论文部分内容阅读
背景及目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是世界上辐射抗性最强的生物之一,pprI基因是DR DNA损伤修复、发挥辐射抗性的关键基因,是DR激活损伤修复途径的总开关。pprA基因具有DNA损伤修复和抗氧化双重功能,pprI在启动子水平调控了ppr A基因的上游表达,可能通过调控recA、pprA等基因的表达来增强辐射保护作用。本实验旨在研究耐辐射奇球菌ppr A、ppr I基因转移及其表达蛋白质的相互作用对真核细胞辐射抗性的影响,为完善DR菌抗辐射调控网络提供基础,为辐射防护基因治疗提供新的思路。方法:1、以实验室前期构建的p GADT-7-pprA、pet28a-pprI载体为模板,构建p EGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI荧光表达载体。脂质体2000介导将pprI、pprA基因表达载体共转入人肾上皮细胞293T,荧光显微镜观察荧光蛋白表达,Western blot检测融合蛋白表达。2、生物信息学分析预测PprA与PprI蛋白的相互作用,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的共定位。3、MTT法检测细胞生存率,克隆形成实验检测克隆形成能力,化学荧光法检测活性氧(ROS)含量,WST-1法检测总超氧化物歧化酶(SOD)活力,微板法检测丙二醛(MDA)含量及还原型谷胱甘肽活力,免疫荧光法检测γ-H2AX焦点数。结果:1、双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示在4700、1000bp处与4800、1100bp处出现目的条带。测序结果显示构建序列与模板序列一致,无移码突变。转染293t细胞荧光显微镜观察到红色和绿色荧光蛋白表达,48-72h荧光强度最大。westernblot结果显示在不同检测水平65kda及60kda大小处有融合蛋白表达。2、string预测ppra与ppri蛋白具有相互作用,其可信得分为0.665分。激光共聚焦显微镜下观察ppra、ppri融合蛋白主要分布在293t细胞的胞质中,免疫荧光实验提示两者存在细胞内共定位。3、与未转染的空白细胞及转染空质粒的对照组细胞相比,单转ppri的细胞和ppra与ppri共转的细胞辐照后生存率明显增高,ros含量明显降低,辐照后细胞的gsh、sod活力明显增高,mda含量明显降低,γ-h2ax焦点数明显减少(p<0.05),且双转组更加明显,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1、pegfp-n1-ppra,pdsred1-n1-flag-ppri重组表达载体成功构建。2、原核生物耐辐射奇球菌ppra、ppri基因能够在真核细胞中共同表达蛋白,且表达的ppra与ppri蛋白可能存在相互作用。3、ppri及ppra+ppri在真核细胞中表达能够提高辐射损伤后细胞的增殖能力,增强细胞的抗氧化能力及dna损伤修复能力,从而提高真核细胞的辐射抗性,且基因双转效果更加明显,ppra与ppri可能存在协同抗辐射作用。