矽肺是最为严重的一种职业病之一,是由于长期吸入大量含有游离二氧化硅粉尘所引起的一种不可逆转的渐进性加重的肺间质纤维化疾病。引起矽肺的主要职业有武警黄金水电部队的开矿挖掘作业,地方各行业如矿山开采、冶金工业中的原料破碎、陶瓷工业的原料加工,这些职业均可导致不同程度的肺纤维化。矽肺患病率逐年增多,造成直接和间接经济损失巨大,是危害最严重的职业病之一,而且已经成为重大社会公共卫生问题。国内外学者对矽肺纤维化的单个细胞因子作用虽已取得了一定的研究进展,但其系统网络调控机制尚未阐明。目的确定矽肺纤维化相关的生物活性介质,构建生物活性介质调控网络及其基因调控网络,以及二者整合网络,以此系统阐明矽肺纤维化的网络调控机制。方法本文主要应用系统生物学的方法构建生物活性介质调控网络。1.生物活性介质的确定。采用RevMan4.2进行meta分析,对研究的偏倚进行漏斗图、异质性、敏感性分析后进而确定相关活性介质。2.初始调控网络的构建。利用meta分析后数据,通过三次样条插值,采用微分方程模型并应用最小二乘法求解加权矩阵,构建活性介质调控网络。3.大鼠矽肺模型及实验后调控网络构建。应用气管暴露法注入二氧化硅粉尘悬液或生理盐水建立大鼠矽肺模型或对照模型。随机将Wistar大鼠分为矽尘组和对照组,每组再分为第1d,第3d,第7d,第14d,第21d,第28d共6个时间点,每个时间点分别取8只大鼠处死,收集相应血清和肺组织后系统检测相关生物活性介质。采用天狼猩红染色法结合偏振光显微镜观察肺组织胶原变化,并用图像分析系统定量分析Ⅰ、Ⅲ型胶原面积比;采用ELISA法系统测定血清中活性介质NF-κB、IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ、TGF-β1、GM-CSF的含量;利用硝酸还原酶法测定NO含量。通过系统检测数据应用相关系数模型和微分方程模型进一步构建调控网络。4.干扰实验对调控网络的校正。同样应用气管暴露法建立大鼠矽肺模型,随机将32只大鼠分为TNF-α干扰组和矽尘组,每组再分为第7d和第14d两个时间点,每个时间点取8只大鼠并检测以上相同活性介质,通过比较两组之间各指标的差异校正调控网络。5.基因调控网络实验确证和扩充。造模后第14d用Trizol提取染矽尘组和对照组中肺组织总RNA,通过Illumina大鼠全基因表达芯片的检测,结合Diffscore差异分值筛选差异表达基因。通过KEGG、GO、DAVID等数据库平台,应用功能富集分析方法以及Cluster、TreeView等工具建立相关细胞因子基因聚类树,并利用差异表达基因相关系数矩阵构建基因调控网络,整合活性介质和基因调控网络,扩充和完善生物活性介质调控网络。结果1.meta分析后肺纤维化相关活性介质为TNF-α、TGF-β1、IFN-γ、MCP-1、IL-4、IL-6、IL-18、MMP-9、IL-10、IL-1β、IL-5、IL-8、IGF-1、GM-CSF、MMP-2、EGF。其中肺组织中TNF-α随时间的变化并不是直线升高,而是呈波浪性升高。肺组织、巨噬细胞、血清活性介质TNF-α各时点变化并不一致,其中巨噬细胞在第1天变化比其余两者更为明显,肺组织除第1天外各时点变化具有显著性差异,血清在各个时点变化均较肺组织表达弱一些。2.当权值阈值为2σ时,肺纤维化活性介质调控网络中重要节点为:IFN-γ、IL-10、IL-1β、IL-18、IL-6、IGF-1、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α;非重要节点的活性介质为IL-4、IL-5、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-9、EGF。当权值阈值为3σ时,肺纤维化活性介质调控网络中重要的节点变为:IFN-γ、IL-10、IL-1β、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α;非重要节点的活性介质为IL-18、IL-6、IGF-1、IL-4、IL-5、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-9、EGF。3.肺组织天狼猩红染色显微镜及图像分析仪观察表明第21天、第28天矽肺模型是成功的。实验组与对照组比较,血清中NF-κB和NO各时间点(除第21天NO外)表达具有统计学意义,动态表达比趋势较为一致。TGF-β1第21天、第28天表达增加,而IFN-γ第21天、第28天表达有降低趋势。TNF-α表达比呈先降低后增高趋势,但整体上与对照组相比没有统计学意义。IL-1β、IL-10、GM-CSF不同时间点动态表达比均大于1,前两者先升高后降低,后者呈波浪性升高。4.调控网络中度大于等于5的节点介质为IFN-γ、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α;度小于5的节点为IL-10、IL-1β、NF-κB、NO、COLⅠ、COLⅢ。TNF-α可溶性受体干扰实验是可行的,该受体能够抑制矽尘诱导的大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的增加,抑制外周血清中NO、IL-1β、TGF-β1、NF-κB的蛋白表达。原调控网络中同TNF-α相关联的介质可能还包括COL I、GM-CSF等介质。5.矽肺纤维化血清中通过功能富集分类得出相关细胞因子基因共有29个,其调控网络中“度”大于5的关键基因为CCL7、GRN、IL-18、SFTPD、SPN、SPP1、TNF-α、TNFRSF。结论矽尘诱发机体活性介质的变化通过网络状态调控肺纤维化的形成。16种生物活性介质(TGF-β1,IFN-γ,MCP-1, IL-4, IL-6,IL-18,MMP-9, TNF-α,IL-10,IL-1β,IL-5,IL-8, IGF-1, GM-CSF, MMP-2, EGF)可能参与肺纤维化的调控,且具有一定的时空变化规律。时间趋势上活性介质的含量不是呈直线性,而是呈波浪性升高或降低趋势,各时点变化并不一致。空间表现上活性介质在细胞中出现最早,血清中出现最晚;各时点在肺组织中表达最强,血清中表达较弱。肺纤维化生物活性介质调控网络中重要节点介质为:IFN-γ、IL-10、IL-1β、GM-CSF、TGF-β1、TNF-α、NF-κB、NO;非重要节点为IL-18、IL-6、IGF-1、IL-4、IL-5、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-9、EGF。在肺纤维化活性介质调控网络中,NO和NF-κB是一个启动中枢,而TNF-α、TGF-β1既担当启动子又担当致纤维化调控网络的中间传递子,GM-CSF、IL-1β、IFN-γ呈现级联瀑布放大或抑制网络效应。在网络效应活性介质促进和抑制功能不平衡的条件下形成肺纤维。