甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶,已被广泛应用于诸多领域。在实际工业生产中不仅需要性质优良的酶制剂而且酶的产量也是影响企业利润的关键因素,因此利用基因工程方法提高甘露聚糖酶的分泌表达量来满足工业应用的需求已成为必然。毕赤酵母表达系统是目前应用较多的高效的外源蛋白表达系统,已广泛应用于表达和生产多种外源蛋白,利用表达载体上的信号肽能很好的引导外源蛋白的分泌,为所表达蛋白的分离纯化带来方便,目前毕赤酵母表达系统中使用最多的信号肽是来自于酿酒酵母的α-factor。然而,不同信号肽介导同一种外源蛋白分泌表达时,外源蛋白的分泌表达效率相差很大,因此改造和筛选毕赤酵母内源的信号肽对提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量具有重要意义。本研究选取了5种毕赤酵母内源信号肽GAS1、DSE4、SCW11、MSB2和EXG1,分别在毕赤酵母X33中介导表达实验室前期改造获得的耐热甘露聚糖酶ManA(Accession No.KJ806637),以α-factor作为参照,摇瓶水平诱导表达的结果显示,GAS1、DSE4、SCW11、MSB2、EXG1和α-factor介导ManA分泌表达的胞外酶活均在120 h达到最大值,分别为302U/mL、329 U/mL、128 U/mL、88 U/mL、114 U/mL和303 U/mL,而120h时对应的胞内酶活分别为65 U/mL、27 U/mL、48 U/mL、96 U/mL、15U/mL和40 U/mL。此外,使用荧光定量PCR方法对5种信号肽介导ManA表达时转录水平的表达量进行分析,与α-factor相比,GAS1、DSE4、SCW11、MSB2和EXG1介导ManA表达时转录水平表达量分别为α-factor的1.03、2.12、0.32、0.21和0.60倍。上述结果表明,与SCW11、MSB2和EXG1相比,DSE4和GAS1能更高效的介导ManA在毕赤酵母X33中的分泌表达,且可有效替代α-factor。信号肽N-末端区域碱性氨基酸和C-末端区域极性氨基酸的改变对介导外源蛋白的分泌表达有一定影响,为进一步提高ManA在毕赤酵母中的分泌表达量,本研究对GAS1和DSE4进行了系列改造,包括在N端第三位氨基酸处引入碱性氨基酸R、K或H和在C端倒数第二位氨基酸处引入极性氨基酸N、K、H、R、Q、D或E。摇瓶水平发酵至120 h时,在GAS1 N端第三位氨基酸处引入R(GAS1-3)介导ManA分泌表达时,与GAS1相比总酶活提高3%,其中上清酶活提高5%,胞内酶活下降2%,且mRNA水平表达量提高1.25倍;GAS1 C端倒数第二位氨基酸处引入K(GAS1-2K)介导ManA分泌表达时,与GAS1相比总酶活提高20%,其中上清酶活提高17%,胞内酶活提高3%,且mRNA水平表达量提高2.64倍;DSE4 N端第三位氨基酸处引入R(DSE4-3)介导ManA分泌表达时,与DSE4相比总酶活提高5%,其中上清酶活提高3%,胞内酶活提高2%,且mRNA表达量提高1.25倍。通过上述对两种信号肽的系列改造,GAS1-3、GAS1-2K和DSE4-3可不同程度的提高ManA在毕赤酵母中的分泌表达量,为外源蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达提供了一定的理论依据。