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研究背景
移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)是同种异体造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)最主要和最常见的并发症，是指移植物组织中的免疫活性细胞与组织相容性抗原不相符的受者之间的反应，严重影响患者的脏器功能和生活质量，成为亟待解决的临床问题。调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是研究最广泛的一类调节性细胞，可通过多种方式抑制T细胞的活化，发挥免疫抑制作用，维持免疫稳态。Treg在GVHD中发挥保护作用，可以抑制T细胞和B细胞等活化，最终减轻GVHD。
CD226，又称DNAX辅助分子1(DNAX accessory molecule-1，DNAM-1)和血小板与T细胞活化抗原1(Platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)，是一种活化型分子，广泛表达于T细胞、自然杀伤(Nature killer，NK)细胞、单核/巨噬细胞和Treg等免疫细胞，参与调控淋巴细胞的分化与杀伤和血小板活化等免疫学过程。既往研究表明血清中可溶型CD226可以作为预测急性GVHD发生的标志物，动物实验也证实干预CD226可以治疗和预防GVHD的发生发展，但Treg上的CD226是否参与GVHD还尚不清楚。CD226表达于Treg表面，而CD226在Treg上的功能也尚存争议。
研究目的
构建Treg细胞CD226特异性敲除(Conditional knockout，CKO)小鼠，明确CD226CKO对Treg功能及GVHD发生发展的影响，并探索可能的分子机制。
研究方法
1)CD226fl/flFoxp3CreCKO小鼠的构建、繁育及鉴定
构建了CD226fl/wt小鼠，同Foxp3Cre小鼠交配，获得同窝CD226fl/flFoxp3Cre和CD226wt/wtFoxp3Cre小鼠。检测小鼠淋巴结①CD4+Foxp3-效应T细胞(Effector T cell，Teff)和CD4+Foxp3+TregCD226表达情况；②CD4+Foxp3+Treg细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4)和T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT)表达情况；③Treg细胞占CD4+T的比例。
2)CD226条件性敲除对Treg细胞功能的影响
建立了单向混合淋巴细胞培养体系(Mixed lymphocyte culture，MLC)，①检测CD4+T和CD8+T细胞增殖分析CD226CKO对Treg功能的影响；②检测CD226CKO对Treg细胞占CD4+T细胞比例和Treg细胞增殖的影响；③检测CD226CKO对TregCTLA-4和TIGIT表达格局的影响。使用Babl/c脾脏来源的淋巴细胞、5μg/mL刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)、CD3/28磁珠刺激分别作为刺激因素，④分析CD226CKO对刺激指数(Stimulation index，SI)的影响。以Babl/c来源骨髓诱导来源DC(Bonemarrow-derived dendritic cells，BMDCs)为刺激细胞，⑤检测CD226CKO对Treg细胞Glut1表达的影响。
3)供体Treg特异性敲除CD226对GVHD的影响
以Balb/c小鼠为受体，8Gy60Co照射清髓处理，辐照后4h，取骨髓和脾脏细胞进行造血重建，①观察供体CD226CKO对于小鼠存活、体重、GVHD临床评分的影响。②GVHD小鼠到达排斥终点时取脾脏称重，取结肠全段测量长度。移植2周后，③取小鼠结肠、小肠、颈部皮肤和肝脏组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin， HE)染色，观察病理改变，计算病理评分；④分别检测小肠、肝脏、淋巴结和脾脏F4/80+巨噬细胞比例；⑤检测肝脏CD3+T、CD4+T、CD8+T和CD3+NK1.1+自然杀伤性T细胞(Natural killer T cell，NKT cell)等免疫细胞的浸润；⑥分析脾脏CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例和数量。
研究结果
1)CD226fl/flFoxp3CreCKO小鼠的构建、繁育及鉴定
CD226fl/flFoxp3CreCKO小鼠构建成功，该小鼠①CD4+Foxp3-T细胞CD226表达正常，而CD4+Foxp3+Treg细胞CD226表达缺失；②Treg细胞CTLA-4表达同对照小鼠Treg细胞相当，但TIGIT表达水平低于对照小鼠Treg细胞；③CD4+Foxp3+Treg细胞比例明显高于对照小鼠。
2)CD226条件性敲除抑制Treg细胞功能和增殖
在MLC体系中，CD226CKO组①CD4+T和CD8+T细胞增殖水平显著高于WT组；②CD4+Foxp3+Treg增殖和比例均明显低于对照组；③Treg细胞表面CTLA-4和TIGIT表达下调，而Glut1表达上调。④CD226CKO抑制了Treg细胞的功能，促进了效应细胞增殖，上调了不同刺激因素条件下的SI。
3)供体Treg特异性敲除CD226加重GVHD
在GVHD模型中，①供体CD226CKO加重GVHD损伤，表现为：小鼠存活率更低，体重下降更为明显，GVHD症状更显著，GVHD临床评分更高。②供体CD226CKO加重GVHD靶器官损伤，表现为：结肠长度缩短更明显，且结肠、小肠、颈部皮肤和肝脏组织等GVHD病理损伤更显著、病理评分更高。③供体CD226CKO增加GVHD靶器官免疫细胞浸润，表现为：增加了肝脏CD3+T细胞浸润，尤其是CD3+NK1.1+NKT细胞；还增加了肝脏巨噬细胞浸润。④供体CD226CKO提高了GVHD小鼠脾脏免疫细胞，尤其是Teff的比例，表现为：脾脏重量增加更显著，脾脏F4/80+巨噬细胞比例明显提高，CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例和数量均明显高于对照组小鼠。
研究结论
成功构建Treg细胞特异性CD226敲除小鼠，发现CD226缺失增加了静息状态下Treg细胞比例，但Treg细胞免疫抑制功能和增殖能力受损；CD226CKO小鼠来源造血干细胞移植的小鼠GVHD损伤更为显著，说明CD226对于Treg细胞发育和功能调控均具有重要作用，其分子机制可能与下调CTLA-4和TIGIT表达、上调Glut1表达有关。
移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)是同种异体造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)最主要和最常见的并发症，是指移植物组织中的免疫活性细胞与组织相容性抗原不相符的受者之间的反应，严重影响患者的脏器功能和生活质量，成为亟待解决的临床问题。调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是研究最广泛的一类调节性细胞，可通过多种方式抑制T细胞的活化，发挥免疫抑制作用，维持免疫稳态。Treg在GVHD中发挥保护作用，可以抑制T细胞和B细胞等活化，最终减轻GVHD。
CD226，又称DNAX辅助分子1(DNAX accessory molecule-1，DNAM-1)和血小板与T细胞活化抗原1(Platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)，是一种活化型分子，广泛表达于T细胞、自然杀伤(Nature killer，NK)细胞、单核/巨噬细胞和Treg等免疫细胞，参与调控淋巴细胞的分化与杀伤和血小板活化等免疫学过程。既往研究表明血清中可溶型CD226可以作为预测急性GVHD发生的标志物，动物实验也证实干预CD226可以治疗和预防GVHD的发生发展，但Treg上的CD226是否参与GVHD还尚不清楚。CD226表达于Treg表面，而CD226在Treg上的功能也尚存争议。
研究目的
构建Treg细胞CD226特异性敲除(Conditional knockout，CKO)小鼠，明确CD226CKO对Treg功能及GVHD发生发展的影响，并探索可能的分子机制。
研究方法
1)CD226fl/flFoxp3CreCKO小鼠的构建、繁育及鉴定
构建了CD226fl/wt小鼠，同Foxp3Cre小鼠交配，获得同窝CD226fl/flFoxp3Cre和CD226wt/wtFoxp3Cre小鼠。检测小鼠淋巴结①CD4+Foxp3-效应T细胞(Effector T cell，Teff)和CD4+Foxp3+TregCD226表达情况；②CD4+Foxp3+Treg细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4)和T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT)表达情况；③Treg细胞占CD4+T的比例。
2)CD226条件性敲除对Treg细胞功能的影响
建立了单向混合淋巴细胞培养体系(Mixed lymphocyte culture，MLC)，①检测CD4+T和CD8+T细胞增殖分析CD226CKO对Treg功能的影响；②检测CD226CKO对Treg细胞占CD4+T细胞比例和Treg细胞增殖的影响；③检测CD226CKO对TregCTLA-4和TIGIT表达格局的影响。使用Babl/c脾脏来源的淋巴细胞、5μg/mL刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)、CD3/28磁珠刺激分别作为刺激因素，④分析CD226CKO对刺激指数(Stimulation index，SI)的影响。以Babl/c来源骨髓诱导来源DC(Bonemarrow-derived dendritic cells，BMDCs)为刺激细胞，⑤检测CD226CKO对Treg细胞Glut1表达的影响。
3)供体Treg特异性敲除CD226对GVHD的影响
以Balb/c小鼠为受体，8Gy60Co照射清髓处理，辐照后4h，取骨髓和脾脏细胞进行造血重建，①观察供体CD226CKO对于小鼠存活、体重、GVHD临床评分的影响。②GVHD小鼠到达排斥终点时取脾脏称重，取结肠全段测量长度。移植2周后，③取小鼠结肠、小肠、颈部皮肤和肝脏组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin， HE)染色，观察病理改变，计算病理评分；④分别检测小肠、肝脏、淋巴结和脾脏F4/80+巨噬细胞比例；⑤检测肝脏CD3+T、CD4+T、CD8+T和CD3+NK1.1+自然杀伤性T细胞(Natural killer T cell，NKT cell)等免疫细胞的浸润；⑥分析脾脏CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例和数量。
研究结果
1)CD226fl/flFoxp3CreCKO小鼠的构建、繁育及鉴定
CD226fl/flFoxp3CreCKO小鼠构建成功，该小鼠①CD4+Foxp3-T细胞CD226表达正常，而CD4+Foxp3+Treg细胞CD226表达缺失；②Treg细胞CTLA-4表达同对照小鼠Treg细胞相当，但TIGIT表达水平低于对照小鼠Treg细胞；③CD4+Foxp3+Treg细胞比例明显高于对照小鼠。
2)CD226条件性敲除抑制Treg细胞功能和增殖
在MLC体系中，CD226CKO组①CD4+T和CD8+T细胞增殖水平显著高于WT组；②CD4+Foxp3+Treg增殖和比例均明显低于对照组；③Treg细胞表面CTLA-4和TIGIT表达下调，而Glut1表达上调。④CD226CKO抑制了Treg细胞的功能，促进了效应细胞增殖，上调了不同刺激因素条件下的SI。
3)供体Treg特异性敲除CD226加重GVHD
在GVHD模型中，①供体CD226CKO加重GVHD损伤，表现为：小鼠存活率更低，体重下降更为明显，GVHD症状更显著，GVHD临床评分更高。②供体CD226CKO加重GVHD靶器官损伤，表现为：结肠长度缩短更明显，且结肠、小肠、颈部皮肤和肝脏组织等GVHD病理损伤更显著、病理评分更高。③供体CD226CKO增加GVHD靶器官免疫细胞浸润，表现为：增加了肝脏CD3+T细胞浸润，尤其是CD3+NK1.1+NKT细胞；还增加了肝脏巨噬细胞浸润。④供体CD226CKO提高了GVHD小鼠脾脏免疫细胞，尤其是Teff的比例，表现为：脾脏重量增加更显著，脾脏F4/80+巨噬细胞比例明显提高，CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例和数量均明显高于对照组小鼠。
研究结论
成功构建Treg细胞特异性CD226敲除小鼠，发现CD226缺失增加了静息状态下Treg细胞比例，但Treg细胞免疫抑制功能和增殖能力受损；CD226CKO小鼠来源造血干细胞移植的小鼠GVHD损伤更为显著，说明CD226对于Treg细胞发育和功能调控均具有重要作用，其分子机制可能与下调CTLA-4和TIGIT表达、上调Glut1表达有关。