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背景H抗原与ABO血型、Lewis血型密切相关，属于Hh血型系统。Hh血型系统存在孟买型和类孟买型两种罕见表型，表现为红细胞上完全或部分缺失H抗原。红细胞上H抗原受控于α-1，2岩藻糖基转移酶基因（α1，2-fucosyltransferase gene，FUT1），已证实FUT1突变可导致孟买型和类孟买型。本实验室在前期研究中通过对FUT1基因编码序列分析，发现类孟买型的一个新突变类型（682A＞G+35C＞T），该复合突变分别导致A12V和M228V氨基酸替换。国内外有关学者认为35C＞T是引起类孟买型的突变点（命名为h4），但我们通过人群频率调查和15种哺乳动物同源的FUT1糖基转移酶氨基酸序列比对，认为35C＞T是多态性位点，应与FUT1酶活性和类孟买型无关，推测应是682A＞G突变引起H抗原减弱。本研究目的旨在从体外实验明确该新突变类型（682A＞G+35C＞T）的机制，从蛋白质和mRNA水平对35C＞T，682A＞G突变和α-1，2岩藻糖基转移酶功能的关系进行研究，以解决35C＞T和682A＞G在体外实验中对H抗原表达的影响。方法1．类孟买型先证者采用血清学和分子生物学技术鉴定，实验以类孟买型先证者基因组DNA为研究对象，经PCR扩增FUT1全长编码序列后割胶回收纯化。通过TOPO TA克隆将目的DNA片段连接至表达载体pcDNA3.1／V5-His，克隆筛选后获取重组质粒DNA进行测序分析，以获取包含有目的基因片段的重组质粒，包括35T、682G+35T和正常对照682A+35C的重组质粒。2．按照常规细胞培养方法在培养板上培养贴壁细胞COS-7细胞株，将重组质粒采用脂质体转染的方法分别转染处于对数生长期COS-7细胞。3．转染后COS-7细胞经G418筛选，采用直接免疫荧光染色的方法于第2天、第3天、第4天、第7天流式细胞术分析细胞表面H抗原的表达情况。4．采用实时荧光定量PCR技术对转染第1天，第2天，第3天的细胞检测mRNA水平FUT1的表达情况，以G6PD为内参基因，FUT1为目的基因，分别选用标准PCR产物和质粒纯品作为标准品做标准曲线对样本进行定量比较。结果1．获取目的基因重组质粒以先证者或正常对照基因组DNA为模板，FUT1F和FUT1R引物对扩增FUT1基因，2％琼脂糖凝胶电泳结果显示可见分子量为1094bp的特异性条带，将其割胶回收片段TOPO TA克隆，提取质粒测序分析结果，分别获取35T、682G+35T和正常对照682A+35C的重组质粒。2．转染后抗原分析通过FITC标记的抗H抗体对转染后COS-7细胞表面的H抗原进行检测，结果显示转染空质粒的COS-7细胞不表达H抗原，第2天后H抗原分别在35T、682G+35T和682A+35C三种重组质粒转染的COS-7细胞膜上表达，表达量随着时间呈现先递增后下降的趋势，在第4天达最大值。与野生型（682A+35C）重组质粒相比，（682G+35T）质粒H抗原的表达量仅为野生型的13.3％，而35T为野生型的52.7％。3．转染后mRNA分析我们通过标准品绘制双标准曲线分别对转染第1天、第2天、第3天的COS-7细胞胞内FUT1目的基因与G6PD内参基因进行了定量分析和比较。结果显示转染后FUT1 mRNA水平随着时间变化呈递减，在第1天（682G+35T）FUT1 mRNA水平仅为（682A+35C）的40％。结论1．实验成功获得了FUT1重组表达质粒，构建了FUT1体外瞬时表达体系，体外从蛋白质水平证实类孟买型H抗原呈弱表达的特点。2．体外从蛋白质水平证实35C＞T可引起H抗原的表达部分下降。3．证实682A＞G+35C＞T复合突变引起H抗原表达明显减少，推测Met228的改变可影响α-1，2岩藻糖基转移酶活性。4．证实682A＞G+35C＞T突变影响FUT1的转录活性。