地龙又名蚯蚓、蛐蟮，是我国最宝贵的传统中药材之一，已有4000余年的入药历史，地龙的蛋白提取物具有药源广泛、不易引起基因突变、不良反应少、生物活性较强、治疗费用低等优势。　　 本实验室前期的研究结果显示当免疫活性地龙肽浓度为100μg/ml和10μg/ml时可显著增强NK细胞的活性，提高NK杀伤率;但与IL-2的协同作用并不明显只有当浓度在100μg/ml时才可增强IL-2的作用;还可以拮抗环磷酰胺和地塞米松的免疫抑制作用，且浓度越大作用越强;在低浓度时（0.1-10μg/ml）亦可活化巨噬细胞，增强其吞噬功能，但在高浓度时此作用消失。近年来有实验表明地龙的免疫活性成分主要为分子量在20KD以下的低分子量肽类即地龙肽(LumbricusPeptide)，地龙肽作为一种新型的生物反应调节剂必将在抗菌、抗肿瘤及免疫相关疾病的治疗中发挥重大作用。　　 前期实验的电泳结果表明分子量在20KD以下的地龙肽主要含有七条带，但具体发挥生物学作用的地龙肽组分仍未明了。本次实验目的为摸索出分离纯化低分子量地龙肽活性组分的最适方法及条件，确定具体发挥生物学作用的地龙肽组分。　　 材料与方法　　 1.地龙为正蚓科爱胜赤子蚓;DEAE SepharoseTM Fast Flow凝胶、CM SepharoseTMFast Flow凝胶、SuperdexTM30pg凝胶由GE Healthcare Bio-Sciencer AB生产;人淋巴细胞分离液由Sigma公司生产;新鲜羊静脉血。　　 2.地龙肽分离和纯化:分为地龙肽的粗分离、超滤、丙酮沉淀、DEAE SepharoseTMFast Flow阴离子交换层析、SuperdexTM30 prep grade凝胶过滤层析四个部分。　　 3.蛋白含量测定:采用Folin-酚试剂法（Lowry法）测定，以BSA为标准蛋白质。　　 4.地龙肽分子量测定:采用Tricine-SDS-PAGE小分子肽电泳及银染法测定。　　 5.糖蛋白的确定:采用高碘酸-Schiff法。　　 6.地龙肽活性测定:采用国家食品药品监督管理局国家药品标准修订件(XGB2003-001)胸腺肽溶液质量标准检测，T细胞活性测定——脱E受体法测定。　　 7.温度对地龙肽热稳定性的影响:设置40-80℃9个温度点、15-60min4个时间点通过脱E受体实验检测不同条件下地龙肽的稳定性。　　 8.人工胃、肠液对地龙肽稳定性的影响:制备人工胃、肠液，分别取胃酶和胰酶与地龙肽的质量比1∶5、1∶20、1∶40，0.5-4h4个时间点通过脱E受体实验检测不同条件下地龙肽的稳定性。　　 9.生物毒性检测:微量溶血实验　　 10.统计学分析:实验所得数据的值均用(X)±SD来表示。用SPSS19.0软件进行one-way ANOVA，p＜0.05，有统计学意义。　　 结果　　 1.地龙肽分离和纯化　　 1.1比较20％三氯乙酸法、50％饱和硫酸铵法和2倍体积丙酮法，得出分子量在3-10KD的组分通过丙酮沉淀可以获得最大回收率。　　 1.2用DEAE SepharoseTM Fast Flow作为离子交换剂，用pH8-9Tris-HCl缓冲液作为平衡液和地龙多肽的溶剂，相对于以CM SepharoseTM Fast Flow作为离子交换剂可获得最佳分离效果。　　 1.3用DEAE SepharoseTM Fast Flow作为阴离子交换剂，pH8-9Tris-HCl缓冲液作为平衡液和地龙肽的溶剂，1M NaCl为洗脱液，洗脱峰明显高于穿透峰，表明地龙肽可得到有效分离。　　 1.4用Sephadex30 pg对DEAE离子交换层析的洗脱峰成分进行凝胶过滤层析，结果显示其仅有一个高尖峰。　　 1.5经Tricine-SDS-PAGE小分子肽电泳法显示其仅有一条带，计算得出其分子量约为10.764KD.　　 1.6经高碘酸-Schiff法测定结果显示地龙肽不含糖成分。　　 2.地龙肽免疫活性的研究　　 2.1制备从2.065-41.300mg/ml20个浓度梯度（浓度倍比稀释）的地龙肽溶液，通过脱E受体实验检测各浓度的E花环形成率，结果显示在一定浓度范围内随着地龙肽浓度的升高E花环形成率逐步升高，具有较好的量效关系。　　 2.2微量溶血实验结果显示地龙肽溶液无溶解绵羊红细胞作用。　　 3.温度和人工胃液、肠液对对地龙肽稳定性的影响　　 3.145℃水浴30min地龙肽的E-RFC仍为17.33±0.76％(p＜0.05)，表明地龙肽有较好的热稳定性。　　 3.2当胃蛋白酶和胰酶与地龙肽的质量比为1∶20，37℃水浴1h时，地龙肽的E-RFC仍为12.34±1.04％(p＜0.05)，表明地龙肽可耐受一定比例胃酶和胰酶的消化作用。　　 结论：　　 1、将地龙粗提组分经分级超滤，得到分子量在3-10KD的组分，再经(A)KTAPurifier100层析系统进行阴离子交换层析和凝胶过滤层析，得到分子量约为10.764KD且不含糖成分的单一组分。　　 2、经脱E受体实验证实所得地龙肽单一组分具有较强的免疫活性，并在一定浓度范围内具有较好的量效关系;微量溶血实验表明该组分无生物毒性。　　 3、所得地龙肽单一组分具有较好的热稳定性，在45℃条件下仍有较强活性;37℃条件下可耐受一定比例胃酶和胰酶的消化作用。　　 4、地龙免疫活性肽作为中药免疫增强剂具有广阔的开发利用前景。