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研究目的本研究旨在检测慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中基质金属蛋白酶-1(Matrix Metalloproteinase-1,MMP-1)启动子甲基化状态,研究MMP-1启动子的甲基化率与CHB患者肝纤维化严重程度之间的联系,从而探究外周血MMP-1基因启动子甲基化在CHB患者临床诊治中的价值。研究方法1.病例选择:本研究纳入CHB患者137例为实验组,均采用经皮肝穿刺活检术取得肝脏组织,采纳Edmondson分级法对病理切片进行病理学分级,其中S0期46人;S1期44人;S2期24人;S3期17人;S4期6人;GO期19人;G1期68人;G2期32人;G3期13人;G4期5人。所有患者均为2013年1月至2015年8月期间在山东大学齐鲁医院肝病科门诊和病房住院患者,CHB的诊断的标准依据2009年美国肝病研究协会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)诊疗指南。纳入健康志愿者28例作为对照组,来自于山东大学医学院的志愿者,无肝炎病毒感染史,肝功正常,无其他系统疾病。2.实验方法:应用试剂盒从PBMCs中提取DNA,重亚硫酸盐处理行DNA甲基化修饰,运用在线MethPrimer软件设计引物,根据修饰后的DNA序列,通过甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)来检测修饰后的DNA标本中MMP-1基因启动子是否能扩增出相应的甲基化或非甲基化片段,若甲基化(M)引物能够扩增出相应片段,则表示MMP-1启动子区域发生了甲基化。3.统计学分析:所有统计数据分析均应用SSPS16.0软件进行。应用Kolmogorov-Smirnov检验来验证数据是否服从正态分布;偏态分布的连续变量用中位数描述,分类变量用相对频数来描述;Mann-Whitney U检验用来检测数值变量之间是否有差异,而应用卡方检验来比较分类变量之间是否存在差异。我们应用卡方检验Fisher确切概率法、独立样本t检验来比较CHB患者及正常对照组之间血清MMP-1启动子甲基化状态的差异性以及CHB患者外周血MMP-1启动子甲基化率与其临床病理特征之间的相关性。MMP-1启动子甲基化以及谷草转氨酶、血小板计数比值(Aminotransferase to platelet ratio index,APRI score)的诊断价值由ROC曲线下面积来表示。P值小于0.05为差异有统计学意义。研究结果1.CHB患者外周血中MMP-1启动子甲基化率明显高于健康对照者(χ2=31.23,p<0.001);2.MMP-1 启动子甲基化率在 S0 与 S1(p = 0.048),S0 与 S3-4(p<0.001),S1与S3-4(p = 0.016),S2与S3-4(p = 0.023)之间存在显著差异,而在S0与S2(p =0.091),S1与S2(p = 0.974)组间差异无统计学意义;3.MMP-1 启动子甲基化率在 G0 与 G2(p=0.004),G0 与 G3-4(p<0.001),G1与G2(p = 0.016),G1与G3-4(p = 0.022)之间存在显著差异,而在G0与G1(p =0.319),G2与G3-4(p = 0.667)组间差异无统计学意义;4.MMP-1启动子甲基化与CHB患者年龄(p=0.188)、性别(p = 0.884)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)(p= 0.081)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)(p = 0.142)、乙型肝炎病毒 e 抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)(p = 0.283)及 Log10(HBV-DNA)(p = 0.355)等临床特征参数之间无显著相关性;5.MMP-1基因启动子甲基化对CHB患者肝纤维化严重程度的预测价值:受试者工作曲线下面积(the area under the receiver operating characteristic curve,AUC)为 0.771,明显高于 APRI score(p=0.041)。结论1.CHB患者组中外周血MMP-1启动子甲基化率升高,与健康对照组相比,其血清MMP-1基因启动子甲基化程度显著升高,提示CHB患者外周血中存在MMP-1启动子区域存在异常甲基化;2.CHB患者组外周血MMP-1基因启动子甲基化率随患者肝纤维化严重程度的增加而升高,与肝纤维化严重程度呈显著相关,提示MMP-1基因启动子甲基化在CHB患者肝纤维化的发生发展过程中起到了重要作用;3.CHB患者组外周血MMP-1基因启动子甲基化率随患者肝组织炎症程度分级的增高而增高,提示MMP-1基因启动子甲基化可能参与肝脏的抗炎反应机制,在炎症的进展过程中发挥作用;4.外周血MMP-1基因启动子甲基化对CHB患者肝纤维化严重程度的预测价值明显高于APRI分数,提示MMP-1基因启动子甲基化可能会成为早期诊断CHB患者肝纤维化理想、有效的生物学标志物,而且MMP-1基因的表达调控及其作用机制的研究可能为CHB患者的诊断提供新思路,并为CHB患者肝纤维化的治疗和逆转提供新的靶点。