论文部分内容阅读
多囊卵巢综合征临床表现多样,常伴有卵泡发育异常、肥胖、胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）、代偿性高胰岛素血症、高雄激素血症和低度炎症,是一种伴有生殖和代谢异常的疾病。因此,正是由于这些临床特征从而导致PCOS患者卵巢内分泌水平会发生改变,卵巢周围小卵泡的聚集、卵巢呈多囊样改变。因此,PCOS患者常常稀发排卵或者无排卵,主要是由于一个月经周期中即使有一批卵泡发育,但由于缺少优势卵泡,该批卵泡仍然发育不成熟而无法排卵。另外,大多数的多囊卵巢综合征女性超重、肥胖或腹部肥胖。肥胖会加剧无排卵、高雄激素血症、IR和炎症这些临床症状的发生。同时也会促使脂肪生成增加,分解减少。这些在脂肪与卵巢之间相互作用,特别是在脂肪过度堆积的情况下,会对卵巢内分泌功能产生的的影响加剧,从而对卵泡发育产生影响并损害卵母细胞的质量。另外,肥胖可以加重IR和几种炎症性脂肪因子的分泌,卵泡膜细胞对黄体生成素（Luteinizing hormone,LH）的刺激也更加敏感,促进了黄体生成素（LH）的分泌并上调了卵巢雄激素分泌相关基因的表达,从而促进雄激素的产生及分泌。因此,患有PCOS的肥胖女性与非肥胖相比女性更有可能有严重的临床表型、不孕、流产和代谢综合征。氧化应激（OS）是指氧化剂的产生过多超过了抗氧化剂自身清除能力而造成的两者之间的不平衡,从而导致氧化还原途径的破坏和分子损伤,它参与人类多种疾病的发生包括T2DM、动脉粥样硬化、肥胖和胰岛素抵抗。活性氧（reactive oxygen species,ROS）和抗氧化剂参与调节人类和动物的生殖过程。活性氧和抗氧化剂之间的不平衡可能导致多种女性生殖疾病。多囊卵巢综合征（PCOS）是导致女性排卵性不孕症的主要原因,是育龄妇女常见的生殖内分泌疾病。其主要发病机制除了与高雄激素血症与胰岛素抵抗有关,与氧化应激有着密不可分的关系。此外,近一半的PCOS患者伴有肥胖,其总游离脂肪酸呈升高的趋势。花生四烯酸（arachidonic acid,AA）是一种多不饱和脂肪酸。AA与各种酶[(环氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450（CYP）]反应产生的氧化产物可以改变细胞线粒体分布和钙离子浓度,并增加ROS的产生。在本研究中,我们分析了正常对照组、正常PCOS组、超重对照组和超重PCOS组四组之间的卵泡液脂肪酸含量,共分析了18种脂肪酸的含量。超重PCOS组棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（C16:1）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1n9c）、亚油酸（C18:2n6c）明显高于超重对照组（P<0.01）。此外,在正常PCOS组中花生四烯酸（C20:4n6）的含量明显高于正常对照组（P<0.01）。在查阅文献及预实验后选择AA进行后续体外实验。此外,为了确定AA是否诱导人卵巢颗粒肿瘤细胞系（KGN）的氧化应激（Oxidative Stress,OS）并影响其相关功能,我们用AA处理KGN细胞,结果表明,AA显著降低了KGN细胞的总抗氧化能力（TAC）,提高了KGN细胞丙二醛（MDA）、ROS和O2-水平,降低了KGN细胞中SOD、CAT、GSH-Px和GR的抗氧化酶活性,并且降低了GSH含量。此外,AA还可损害KGN细胞的分泌功能和线粒体功能,并诱导其凋亡,而添加还原性谷胱甘肽（Reduced Glutathione,GSH）后恢复了KGN细胞的总抗氧化能力,降低了KGN细胞丙二醛（MDA）、ROS和O2-水平,恢复了KGN细胞中SOD、CAT、GSH-Px和GR的抗氧化酶活性,以及提高了GSH含量。此外,添加GSH改善AA对KGN细胞的分泌和线粒体功能的损害以及AA的促凋亡作用。此外,我们进一步采用了RNA-seq的方法研究了AA对KGN细胞功能影响的下游靶基因及其作用机制。我们发现AA上调了生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）的表达,对炎症和组织损伤具有保护作用。因此,我们研究了AA诱导的KGN细胞中氧化应激（oxidative stress,OS）是否会作为OS反应上调GDF15的表达。我们发现沉默GDF15显著降低了KGN细胞的总抗氧化能力（TAC）,提高了KGN细胞丙二醛（MDA）、ROS和O2-水平,抑制了KGN细胞中SOD、CAT、GSH-Px和GR的抗氧化酶活性,并且降低了GSH含量。此外,沉默GDF15还可损害KGN细胞的分泌功能和线粒体功能,并诱导其凋亡,而并补充重组GDF15（r GDF15）后恢复了KGN细胞的总抗氧化能力,降低了KGN细胞丙二醛（MDA）、ROS和O2-水平,恢复了KGN细胞中SOD、CAT、GSH-Px和GR的抗氧化酶活性,并且提高了GSH含量。此外,改善AA对KGN细胞的分泌和线粒体功能的损害以及AA的促凋亡作用。我们发现GDF15作为一种OS反应表达,可以保护KGN细胞免受AA诱导的氧化应激以及分泌功能、线粒体功能的损害和凋亡。因此,本研究提示AA可能诱导KGN细胞中OS,并上调GDF15的表达作为应激反应。综上所述,本研究显示,通过对PCOS组及对照组卵泡液脂肪酸的检测发现超重PCOS组卵泡液中棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（C16:1）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1n9c）、亚油酸（C18:2n6c）明显高于超重对照组。此外,正常PCOS组花生四烯酸（C20:4n6）的含量明显高于正常对照组。AA诱导氧化应激,提高了细胞内ROS、O2-和MDA水平,抑制了抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和GR的活性及减少了GSH的含量,并且导致KGN细胞线粒体及分泌功能的紊乱并促进细胞凋亡水平。GDF15在花生四烯酸诱导的KGN细胞氧化应激中上调,而且缓解了KGN细胞的氧化应激水平,改善KGN细胞的线粒体及分泌功能,降低了KGN细胞的凋亡水平。研究结果为进一步探明PCOS的发病机制、提高卵母细胞质量从而改善其妊娠结局提供了重要的理论依据。