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乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染可引起急、慢性乙型肝炎,肝硬化,并与原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生发展关系密切。但其致病机制尚未明确。HBs蛋白由HBV编码的一种包膜蛋白,参与完整HBV Dane颗粒的装配、球形颗粒(secreted sphere)和管形颗粒(secreted filament)的组装,大量存在于HBV感染者血清中。研究发现HBs可影响细胞生理功能,如糖类和脂类代谢,细胞生长和细胞凋亡过程。本课题组前期通过Q-PCR的方法,检测了16种载脂蛋白(Apo)基因。其中载脂蛋白AII(Apolipoprotein A2,APOAII)在HBV稳定表达细胞株HepG2.2.15中低于对照细胞株HepG2,提示HBV可降低APOAII的表达。在此基础上,进一步讨论HBs影响APOAII的转录与表达的调控机制,有助于进一步了解HBV相关发病机理。我们首先在第一部分探讨HBV特别是HBs对APOAII mRNA水平及蛋白水平的影响。通过稳定表达HBV的细胞株及瞬时转染含有1.2倍体HBV基因组DNA,进一步构建HBs重组腺病毒,命名为Ad-HBs,采用Q-PCR和Western blot方法检测APOAII的mRNA水平和蛋白表达水平的变化,证明HBV及HBs能够使APOAII基因在mRNA水平和蛋白水平下调。其次,在第二部分我们研究HBs使APOAII基因表达下调的机制。我们首先构建了APOAII基因启动子区全长(-2700nt~+50nt)及分段报告基因重组表达载体,结果表明-1029nt~+50nt区域保留APOAII启动子最大活性。通过对apoAII启动子最大活性区域可能存在的顺式作用元件进行逐个定点缺失(A-N共14个元件),克隆到pGL4.10载体,构建顺式作用元件缺失重组载体并转染至HepG2细胞,分别检测细胞萤火虫荧光素酶(luciferase)相对活性,结果提示A元件(-40nt~-33nt)、B元件(-65nt~-42nt)、C元件(-126nt~-110nt)、H元件(-573nt~-554nt)、K元件(-760nt~-743nt)、L元件(-803nt~-773nt)等6个元件为APOAII启动子上关键的活性元件。在此基础上,以Ad-HBs或Ad-GFP感染细胞,luciferase筛选HBs具体调控的顺式作用元件,结果表明K元件为HBs下调APOAII表达的关键作用元件。使用TESS与TFSEARCH在线软件预测K元件上可能存在哪些转录因子的结合位点,发现K元件(-760nt~-743nt)区域包含了肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α),CCAAT/增强结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ),CCAAT/增强结合蛋白γ(CCAAT/enhancer binding proteinγ,C/EBPγ),环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein 1,CREB)等转录因子结合位点。进一步构建C/EBPβ、C/EBPγ、CREB过表达载体转染入HepG2细胞可以使APOAII转录下调,构建HNF4α过表达载体可使APOAII转录上调。进一步运用凝胶阻滞实验(体外)以及染色质免疫共沉淀实验(体内)表明HNF4α、C/EBPβ、C/EBPγ和CREB特异结合于APOAII K元件的启动子区域。为了进一步验证HBs对潜在转录因子的影响,通过以Ad-HBs或Ad-GFP感染细胞,Q-PCR及western blot筛选HBs具体调控哪个转录因子。结果显示HBs可以上调C/EBPβ、C/EBPγ、CREB转录与表达,下调HNF4α转录与表达。因此,我们得出HBs通过上调C/EBPβ、C/EBPγ、CREB,下调HNF4α转录与表达,从而下调APOAII的转录与表达。