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鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的集约化养鸡场最常见的寄生虫病,每年给全球养鸡业造成的经济损失达30亿美元。ApiAP2（Apicomplexan AP2）蛋白是顶复门原虫AP2（Apetala2）蛋白的简称,是一类特异的转录因子。研究发现疟原虫的ApiAP2蛋白能与含特定基序的DNA序列结合,调控疟原虫的生长发育,是药物开发和疫苗设计的靶点。迄今,关于艾美耳球虫ApiAP2蛋白的研究尚无见有报道。本课题组前期对毒害艾美耳球虫第2、3代裂殖子和配子体进行转录组测序分析时获得了 5个编码ApiAP2假定蛋白的mRNA序列,本研究选取其中的一个基因序列进行克隆、表达,对天然蛋白进行定位分析。最后,用重组蛋白rEnApiAP2单独免疫或与重组配子体蛋白联合免疫雏鸡,评价重组蛋白对毒害艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护效果。研究结果为阐释ApiAP2蛋白调控球虫生长发育的作用机制及研制鸡球虫病亚单位疫苗奠定了基础。1.EnApiAP2基因的克隆、原核表达及其蛋白定位分析分离纯化毒害艾美耳球虫的第3代裂殖子,提取总RNA,反转录成cDNA;以cDNA为模板,PCR扩增EnApiAP2基因序列,并克隆至pMD18-T载体,取阳性克隆测序;将测序正确的EnApiAP2基因克隆至pET28a（+）表达载体,转化至表达菌BL21（DE3）;在对重组菌中表达载体测序鉴定后用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定;用纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体;利用多克隆抗体,分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位;最后,应用qRT-PCR分析EnApiAP2在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示:EnApiAP2基因全长为1830bp,与Genbank中EnApiAP2基因序列（XM013583028.1）的同源性为99.8%,编码610个氨基酸,分子质量为67.69 kDa;预测该基因编码的蛋白含有一个AP2结构域,含有25个抗原决定簇;重组蛋白大小约74kDa,主要以包涵体形式存在,可以被6×HIS标签单抗、鼠抗重组蛋白多抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别;在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白,分子质量大约为85 kDa;EnApiAP2蛋白定位在第3代裂殖子细胞核内;EnApiAP2基因在第3代裂殖子阶段上调表达。2.毒害艾美耳球虫重组蛋白rEnApiAP2的免疫保护力分析将50只龄黄羽鸡分成5组,即:重组蛋白高剂量免疫组（200μg）、重组蛋白中剂量免疫组（100 μg）、重组蛋白低剂量免疫组（50 μg）、未免疫攻虫组（UC）、未免疫未攻虫组（UU）,在7、14日龄分别免疫,21日龄时攻毒害艾美耳球虫;以存活率、排出血便数、平均增重、相对增重率、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数和血清特异性抗体水平为指标,评价重组蛋白rEnApiAP2的免疫保护效力。结果显示,rEnApiAP2以每鸡50 μg的免疫剂量保护效果最好,其抗球虫指数值最高（155.25）,接近抗球虫中效水平;与未免疫攻虫组相比,重组蛋白rEnApiAP2免疫组的病变记分显著降低、平均增重显著增高（P＜0.05）,卵囊排出减少;免疫组的血清特异性抗体水平显著高于未免疫攻虫组（P＜0.05）。3.三种重组配子体蛋白rEtGAM的免疫保护效果比较以黄羽鸡为试验动物,将三种重组配子体蛋白rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59分别单独免疫或两两间联合免疫雏鸡,以上述（第二章）指标评价重组蛋白单免或联免对柔嫩艾美耳球虫或毒害艾美耳球虫免疫保护效果。结果显示:用柔嫩艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM22与rEtGAM59联免组的相对增重率和ACI值均最高（86.71%,163.71）,rEtGAM59单免组平均病变记分最低、卵囊减少率最高（59.61%）;用毒害艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM22与rEtGAM59联免组相对增重率最高（83.06%）,rEtGAM56与rEtGAM59联免组平均病变记分最低、抗球虫指数最高（158.23）,rEtGAM56单免组卵囊减少率最高（66.97%）。各免疫组血清特异性抗体水平均显著高于空白对照组（P＜0.05）,其中rEtGAM56单免组血清特异性抗体水平最高,且显著高于其他免疫组（P＜0.05）。4.重组蛋白rEnApiAP2与rEtGAM的联合免疫保护效果以黄羽鸡为试验动物,将三种重组蛋白rEnApiAP2、rEtGAM56和rEtGAM59分别单独免疫或两两间联合免疫雏鸡,以上述（第二章）指标评价重组蛋白单免或联免对柔嫩艾美耳球虫或毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:用柔嫩艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM59单免组的相对增重率（84.88%）、卵囊减少率（51.16%）和ACI值（151.88）均最高,但rEnApiAP2与rEtGAM59联免组的平均病变记分最低。用毒害艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM59单免组的相对增重率最高（91.26%）,rEtGAM56单免组的平均病变记分最低、卵囊减少率最高（64.36%）,rEnApiAP2与rEtGAM56联免组的抗球虫指数最高（169.83）。各免疫组血清特异性抗体水平均显著高于对照组（P＜0.05）,其中rEtGAM56单免组最高,且显著高于其他免疫组（P＜0.05）。结论:克隆并原核表达了EnApiAP2基因,EnApiAP2蛋白定位于虫体的细胞核。重组EnApiAP2对毒害艾美耳球虫有一定的免疫保护力,rEnApiAP2与rEtGAM56联免能增强对毒害艾美耳球虫的免疫保护力。rEtGAM59单免或与rEtGAM22联免的抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果较好,rEtGAM56单免或与rEtGAM59联免的抗毒害艾美耳球虫的保护效果较好。