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目的:研究胶质细胞系源性神经营养因子(glia cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)与17β-Estradiol(E2)协同保护中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经细胞的作用,并探讨PI3-K/Akt信号通路介导其协同保护作用的可能机制。
方法:本研究以培养的新生1～3天的SD大鼠中脑黑质脑片为研究对象,脑片培养至7天时,碘化丙啶(PI)染色检测培养脑片中细胞的活力,并取细胞活力良好的脑片做后续实验。首先以200μmol/L6-羟多巴胺(6-OHDA)作用于已培养7天的脑片1小时诱导细胞损伤,然后将培养的脑片分为8组:正常对照组、溶剂对照组、GDNF组、E2组、GDNF+E2组、Wortmannin(PI3-K特异性阻断剂)+GDNF组、Wortmannin+E2组、Wortmannin+GDNF+E2组,各组脑片再培养15min后进行后续实验,其中Wortmannin在GDNF或(和)E2加入前1小时加入。免疫荧光双标染色观察黑质致密部(substantia nigracompacta,SNc)中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)与Akt共表达情况;Western Blot方法检测TH、p-Akt、Bcl-2、Bad、Procaspase-3的表达情况。
结果:中脑脑片培养至第7天时,可见边缘细胞清晰并有长的突起伸出,贴壁良好,PI染色结果显示细胞活力较好;免疫荧光染色结果显示脑片SNc中有TH+细胞;免疫荧光双标染色结果显示SNc中所有TH+细胞均表达Akt,TH+/Akt+细胞为胞浆着色;Western Blot检测结果显示在GDNF+E2组,TH的表达比单用GDNF或E2时显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);GDNF+E2组中Bcl-2、Procaspase-3的表达比单用GDNF或E2时增高,而Bad的表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05);GDNF、E2及GDNF+E2组中Akt磷酸化水平都是升高的,与相应的溶剂对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);所有加入Wortmannin组与相应的未加Wortmannin各组相比,TH、Bcl-2、Procaspase-3的表达是降低的,Bad的表达是升高的,差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:在本实验条件下,GDNF与E2对DA能神经细胞有协同保护作用;PI3-K/Akt信号通路介导了GDNF与E2的协同保护作用,其机制可能是通过调节其下游的凋亡调控因子Bcl-2、Bad及Procaspase-3的表达而实现的。