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目的:胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。因早期无特异表现,大多数的胰腺癌患者在就诊时已有局部的扩散和转移。尽管现在手术切除率有很大提高,但预后仍很差。故当务之急是要深入研究与胰腺癌密切相关的基因表达谱的改变,找出与恶性肿瘤发生发展、生物学特性、治疗敏感性及不同预后有关基因,以指导其早期诊断、癌症特征分析和预后判断。近年来ras基因突变与胰腺癌的关系引起较高的关注。其中K-ras基因与胰腺癌的关系得到了广泛研究,而对于R-ras在胰腺癌中的表达研究,目前尚未见报道。本研究旨在了解人胰腺癌组织中R-ras的表达情况及其与胰腺癌组织分化程度的关系,并初步探讨R-Ras基因在胰腺癌发病过程中的作用及其机制。方法:采用免疫组织化学法检测67例人胰腺癌与癌旁组织中R-ras蛋白表达水平并同P21 ras与PCNA的表达情况进行比较,阳性对照为已知阳性的胰腺癌切片,空白对照为已知阳性的胰腺癌切片,不加二抗,以PBS代替。光镜下观察以细胞浆或细胞核内出现棕黄色细颗粒为阳性,采用双盲法计数1000个癌细胞,按阳性细胞所占百分比确定:阳性细胞数＜5%为阴性(-),阳性细胞数5%～24%为弱阳性(+),阳性细胞数25%～50%为中度阳性(++),阳性细胞数＞50%为强阳性(+++)。计算阳性率时将阳性细胞数≥5%统一计为阳性。所有数据采用SPSS 10.0软件包进行统计学分析。率的比较采用卡方检验,组间比较采用秩和检验,等级分组资料比较采用Ridit法,用Spearman方法进行相关性分析,规定P＜0.05为差异有统计学意义。设计合成引物,高保真PCR法扩增R-ras全长序列,构建pcDNA3.1(+)-R-Ras重组质粒并扩大培养;采用Lipofectamine 2000脂质体转染方法,将上述重组质粒转染至panc-1胰腺癌细胞,采用MTS法进行细胞增殖检测。并采用Corning公司的Transwell体外侵袭方法检测转染至上述重组质粒后panc-1胰腺癌细胞的体外侵袭能力改变情况。用western法分析panc-1胰腺癌细胞转染pcDNA3.1(+)-R-Ras重组质粒后MAPK通路中Erk1/2,p38和JNK/SAPK的改变;并检测JNK抑制剂SP600125对转染后panc-1胰腺癌细胞体外细胞增殖影响。结果:1.R-ras蛋白在原发性胰腺癌中表达水平升高免疫组织化学检测表明R-ras、P21ras及PCNA在原发性胰腺癌中阳性表达率明显高于癌旁组织中相应阳性表达率,其差异有统计学意义。按分化程度分组比较R-ras蛋白在胰腺癌中阳性表达率高于相应癌旁组织中阳性表达率,均P=0.000;胰腺癌组织中R-ras蛋白阳性表达率在不同分化程度的各组间比较差异无统计学意义(X~2=0.664,P=0.717);胰腺癌组织中R-ras阳性表达水平在不同分化程度的各组间比较差异也无统计学意义(X~2=1.4674,P=0.480,Ridit test)。2.R-Ras促进细胞增殖为探讨R-Ras对细胞增殖的影响,我们分别将pcDNA3.1(+)-R-Ras和pcDNA3.1(+)空载体瞬时转染经同步化的胰腺癌细胞系,48h后用MTS测定细胞增殖情况。结果表明与空白组细胞和转染pcDNA3.1(+)空载体细胞相比,转染R-Ras后细胞增殖加快(P＜0.05,ANOVA)。提示R-Ras能够促进胰腺癌细胞的增殖。3.R-Ras通过JNK途径促进细胞增殖为分析R-Ras促进细胞的作用机制,我们进一步分析了MAPK通路中Erk1/2,p38和JNK/SAPK的改变,发现转染R-Ras后主要是激活了JNK的活性,用JNK特异性抑制剂10 nM SP600125抑制JNK的活性后,显著抑制了胰腺癌细胞的增殖。4.表达R-Ras并不提高细胞的侵袭力为分析胰腺癌细胞在其JNK途径被激活后对细胞生物学效应的影响。我们用Transwell的方法分别比较分析了转染R-Ras细胞在体外侵袭能力的改变。结果示转染R-Ras细胞无论在有或无血清下,均不明显改变其体外侵袭能力。(P＞0.05,ANOVA)。提示胰腺癌细胞表达R-Ras可能不增加其侵袭性。结论:1.R-ras基因在原发性胰腺癌中表达增加,但R-ras蛋白阳性表达水平与胰腺癌分化程度无相关性,R-ras可能参与了胰腺组织癌变的早期阶段。2.R-Ras高表达能够促进胰腺癌细胞的增殖,其机制可能是通过激活JNK通路而促进细胞增殖。3.R-Ras基因在胰腺癌细胞中高表达并不增加其侵袭性。