三阴性乳腺癌因缺乏受体无法进行内分泌治疗和靶向治疗,具有预后差、复发率高的特点,亟需寻求对三阴性乳腺癌更有效的治疗手段。CAR T免疫疗法在血液肿瘤中取得成功,为其在三阴性乳腺癌中应用提供了依据。间皮素(Mesothelin,Meso)在部分三阴性乳腺癌中过量表达,此外,PD-1对T细胞衰竭起非常重要的作用。我们推测可以从正向和反向两方面增强T细胞免疫活性。本论文构建Meso-CAR的慢病毒载体,包装病毒并感染T细胞,获得Meso-CAR T细胞,并对构建的Meso-CAR T细胞做其效应性功能测定。我们通过流式细胞法检测了不同乳腺癌细胞系MCF-7、Hs578t、MDA-MB-231及BT549间皮素的表达情况,结果表明三阴性乳腺癌细胞系BT549能够表达Mesothelin。我们转染BT549、MCF-7细胞并经单克隆筛选,各获得一株能够高比例表达Luciferase的细胞株。与没有经基因改造的T细胞相比,在Meso~+细胞BT549或Hela的刺激下,细胞内因子染色结果中清晰可见部分Meso-CAR T细胞有IL-2和IFN-γ的高表达(Hela分别为2.1%和3.15%,BT549分别为0.55%和2.15%),而Meso~-细胞MCF-7组则没有观察到。ELISA结果也表明当Meso-CAR CD4~+和CD8~+T细胞与Hela或BT549共培养,其细胞因子IL-2和IFN-γ的表达上调(Hela分别为350pg/mL和1100pg/mL,BT549分别为75pg/mL和350pg/mL),而对照Meso~-细胞MCF-7组同样没有观察到表达的变化。此外,将表达Luciferase的细胞系BT549或MCF-7与Meso-CAR CD4~+和CD8~+T细胞混合做杀伤性实验,结果表明在E:T=2:1情况下,Meso-CAR T可特异性杀伤74%的BT549。CD107a的染色结果也间接证明了Meso-CAR T细胞的细胞杀伤能力(Meso-CAR T细胞CD107a在Hela组为6%,BT549组为7%vs.MCF-7组为2%)。这些结果都说明我们构建的Meso-CAR T细胞可以特异地识别细胞表面的间皮素,从而上调自身的细胞因子的表达,并杀伤靶细胞。我们同时也研究了CRISPR技术下调原代T细胞PD-1基因的可行性。通过流式细胞法检测到不同乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及BT549中都表达PD-L1。6个不同PD-1靶向序列作为sgRNA序列体外合成后,分别被插入带有Cas9基因的慢病毒载体pLentiCRISPR中,构建了靶向基因PD-1不同位点的pLentiCRISPR载体。包装慢病毒并感染原代T细胞后,通过流式细胞法分析CRISPR技术敲除对PD-1表达的影响,结果证明原代T细胞的激活状态与PD-1的表达相伴随,以及PD-1高表达细胞群中存在CD25共表达现象。含有靶向基因PD-1的CRISPR病毒分别感染T细胞后,PD-1-2和PD-1-6对PD-1高表达的细胞群敲除效率最好,分别为19%和29%。这些结果表明CRISPR技术可在原代T细胞中有效敲除PD-1。目前肿瘤的免疫治疗正处于一个过继性T细胞治疗的黄金时期,对其基础免疫学的深入了解将有助于我们提出多种策略把对淋巴瘤和黑色素瘤成功治疗的效果拓展到实体肿瘤。本课题将针对抗原间皮素,研究其在三阴性乳腺癌治疗的可行性,同时研究了敲除免疫抑制基因PD-1的可行性,为三阴性乳腺癌的免疫治疗提供思路。