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心脑血管血栓性疾病是人类的近年面临的头号杀手。溶栓和抗凝药物组合应用是临床治疗血栓疾病主要给药方案,出血倾向是血栓治疗的主要副作用。为提高葡激酶的选择性、降低葡激酶的临床用药量,同时,降低水蛭素在非血栓部位的浓度或活性从而减小出血的危险,我们利用水蛭素对凝血酶的高亲和性和N—末端延伸引起活性降低的特性,首次设计并构建了通过含有凝血因子FXa识别的六肽连接的葡激酶与水蛭素的融合蛋白,使之具有靶向溶栓抗凝双功能和减小出血倾向等特性。 融合蛋白在毕赤酵母中表达时,葡激酶因第28位天冬酰氨被糖基化而失去活化纤溶酶原活性。Val29突变为Pro的突变体（V29P）基因构建到pPIC9K载体并在甲醇利用型毕赤酵母中得到高效分泌表达,甲醇诱导96h,摇瓶发酵表达量达到1g/L,发酵上清液目的蛋白含量占总蛋白的70%以上,第28位天冬酰氨不发生糖基化;但表达产物不可逆地丧失葡激酶的活化纤溶酶原活性。研究还表明,葡激酶的Asn28、Thr30分别突变为Gln、Ile的突变体均完全丧失活性。计算分析表明,所突变的三个氨基酸使得葡激酶的β折叠结构受到破坏,影响了葡激酶与纤溶酶原的结合,从而使之活性丧失,同时表明SAK的24至30位氨基酸残基形成的β折叠结构对维持其活性和功能是必需的。 将融合蛋白基因克隆到pBV220载体并在大肠杆菌中得到了高效表达。融合蛋白以可溶性蛋白的形式存在与大肠杆菌的细胞质中,采用反复冻融提取、离子交换和凝胶过滤方法纯化了目的蛋白,纯度达96%以上。① 融合蛋白对凝血酶具有一定的靶向性② 完整的融合蛋白具有显著的溶栓功能,丧失抗凝活性,从而可减小出血倾向;但融合蛋白在FXa作用下发生裂解,从而释放出游离水蛭素具有抗凝功能,表明融合蛋白可在血栓部位具有靶向溶栓抗凝双功能。③ 采用卡拉胶诱导的小鼠尾部血栓动物模型实验表明,融合蛋白组小鼠尾部血栓较葡激酶组明显降低,同时尾部血栓形成频率也明显减少,表明融合蛋白具有更好的抗血栓效果。融合蛋白具有良好的应用开发前景。