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目的:用同源重组的方法构建大鼠甘油二酯激酶γ(DGKγ)慢病毒过表达载体,为进一步研究DGKγ在神经上皮细胞的作用机制提供实验基础。方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录得到的cDNA作为模板,通过PCR反应分别扩增大鼠DGKγ基因CDS区5’端1029bp和3’端1362bp作为同源重组片段,片段一和片段二之间有24bp重叠序列,设计引物时在片段一上游引物的5’端和片段二下游引物的5’端分别引入15-25bp与线性化载体末端相同的碱基序列;限制性内切酶酶切穿梭质粒使线性化,利用同源重组技术将扩增得到的两个同源重组片段与线性化载体进行定向连接,重组产物转化感受态细胞,用氨苄青霉素筛选阳性单克隆,进行菌液培养;随机选取两个阳性单克隆的菌液,提取质粒进行PCR扩增及扩增产物送测序鉴定,鉴定正确的质粒命名为CMV-rat DGKγ-GFP;将CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒质粒载体与慢病毒包装系统共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以CMV-GFP空载体作为对照;收集慢病毒毒液感染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达,用嘌呤霉素筛选GFP阳性细胞,收集细胞应用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测细胞中DGKγmRNA和蛋白的表达。结果:1.CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒质粒载体经PCR扩增得到大小为1029 bp和1362bp的片段,产物测序结果与片段一和片段二的序列匹配。2.CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体与包装质粒共转染293T细胞后,48h后荧光显微镜下观察到大部分细胞呈GFP阳性,可见部分细胞发生融合。3.收集的慢病毒感染293T细胞24h后,部分细胞有较强的绿色荧光,呈GFP阳性。4.荧光定量PCR结果显示CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染组较空载体组,DGKγmRNA的表达量显著升高(P<0.01)。5.Western Blotting结果显示CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染组较空载体组,DGKγ蛋白的表达量极显著升高(P<0.001)。结论:成功构建了大鼠DGKγ慢病毒过表达载体,DGKγ在293T细胞有效高表达。