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目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我国肝细胞肝癌发生的主要原因,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在HBV感染所致肝癌的发生过程中具有重要的作用。作为多功能调节蛋白,HBx参与调控细胞凋亡、细胞周期进程、细胞增殖和迁移等多种细胞内过程。HBx作为一个反式激活子,可以和转录因子相互作用进而调节宿主基因表达。有研究表明许多细胞内基因,增强子/启动子元件,转录因子如(AP)-1、NF-κB、CREB、(ATF)/cAMP等参与HBx介导的肝癌发生。然而,HBx通过调节基因转录进而诱导肝癌发生的具体机制至今尚未明确。ARID2(AT-rich interactive domain-containing protein 2)基因是SWI/SNF复合物中PBAF(Polybromo-associated BRG1-associated factor)家族的一个亚基。ARID2有2个典型的结构域:即N-端保守的ARID结构域和C-端两个保守的C2H2锌指结构。锌指结构不仅能结合DNA,也能结合RNA,蛋白质等。ARID相关蛋白通过核受体参与配体依赖的转录激活,具有细胞系基因调节、胚胎发育、细胞周期控制等多种生物学功能,ARID2基因也参与肿瘤的发生发展。近年来,在多种实体肿瘤中发现ARID2存在失活突变,如肝癌,黑色素瘤,非小细胞肺癌,胃癌等。本课题组之前研究发现肝癌组织中ARID2的表达明显下调,且ARID2的低表达与肝癌细胞的增殖迁移能力密切相关。本研究旨在深入观察hbx对arid2的转录调节及调控的具体分子机制,以进一步理解hbv参与肝细胞癌发生的致病机理。方法:1)分别在hbv复制的肝癌细胞、hbx瞬时或稳定表达肝癌细胞株以及hbv转基因小鼠中,通过westernblot检测arid2的表达水平。在hbv相关肝癌组织标本中,通过免疫组化检测arid2的蛋白表达水平,通过real-timepcr技术检测arid2与hbx表达水平的相关性;2)在肝癌细胞中,构建arid2启动子pgl3-arid2和间隔逐段缺失的arid2启动子荧光素酶报告质粒,观察hbx对arid2启动子活性的影响及hbx调控arid2启动子的关键区域;chip(染色质免疫共沉淀)观察hbx调控arid2基因启动子区的结合变化;3)根据筛出的关键区域寻找特异性转录因子,在肝癌细胞中通过双荧光素酶活性、染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)等实验进行验证;4)在稳定表达hbx的肝癌细胞中观察arid2过表达对肝癌细胞增殖、迁移能力的改变。结果:westernblot实验发现:在肝癌细胞和hbv转基因小鼠中,hbv复制可以下调arid2表达,其中hbx可以显著下调arid2蛋白的表达,其他蛋白如hbc,hbs作用不显著;相比野生型hbv复制肝癌细胞,hbv复制细胞中含hbx缺失突变可以有效回复arid2的表达,在此基础上外源性补充hbx蛋白,arid2的回复表达被拮抗;在肝癌细胞中,瞬时和稳定表达hbx均可以明显下调arid2的表达。免疫组化发现:在hbv相关肝癌组织标本中,与癌旁组织相比,肿瘤组织中arid2表达明显下调;相关性分析表明hbx与arid2的表达呈负相关。双荧光素酶活性实验发现:与pgl3-basic相比,arid2基础活性增高显著,约15倍;过表达hbx后,arid2启动子活性受到明显抑制,且呈剂量依赖关系;hbx调控arid2基因表达的关键区域位于启动子上游-1040to-601bp附近;chip(染色质免疫共沉淀)实验证实hbx不能直接作用于arid2启动子区。提示hbx在转录水平间接抑制arid2的表达。转录因子预测软件预测、real-timepcr和westernblot筛选出差异表达转录因子atoh1;双荧光素酶活性实验发现:过表达atoh1可回复hbx介导的arid2转录抑制作用;在稳定表达hbx的肝癌细胞系中,过表达atoh1可使hbx介导的arid2抑制作用消失;chip实验结果表明:过表达hbx可以抑制atoh1结合于arid2的启动子区;atoh1敲低后arid2的表达下调;双荧光素酶活性实验发现:与野生型相比较,hbx对atoh1结合位点突变的arid2抑制活性几乎完全消除。ip实验证实:hbx不能与atoh1直接结合。综上,hbx通过抑制atoh1表达进而转录抑制arid2的表达。transwell和edu实验证实:过表达arid2能够部分逆转hbx促肝癌细胞迁移和增殖效应。westernblot实验发现:过表达arid2诱导emt标志物e-cadherin的蛋白表达增加。结论:hbx通过转录因子atoh1间接抑制arid2的表达。hbx下调arid2的表达,促进肝癌细胞的迁移和增殖能力,进而参与hbv相关肝癌发生发展。本研究为HBx参与肝细胞癌的发生发展提供了新的理论依据。