血吸虫是一种雌雄异体的吸虫纲裂体吸虫,能够感染多种哺乳动物,引发影响全球近两亿三千万人口的严重寄生虫病。在我国主要流行的是日本血吸虫病,主要的治疗药物为吡喹酮。由于缺乏有效的疫苗及受到可能出现耐药性的威胁,目前对于血吸虫的研究还任重道远。蛋白激酶能够磷酸化蛋白底物使其构象或活性发生改变,调控生物体内多个细胞进程,可作为良好的药物设计靶标。蛋白激酶可以分为真核蛋白激酶(e PKs)和非典型蛋白激酶(a PKs),其中非典型蛋白激酶不具有保守催化结构域,但具有激酶活性。Rio激酶是非典型蛋白激酶13个家族成员之一,在从古菌到人类的几乎所有物种中保守存在,RIO激酶家族有Rio1,Rio2,Rio3和Rio B四个成员。在对酿酒酵母的研究中发现RIO激酶参与了核糖体前体的组装以及细胞周期进程,其中Rio2对于18S r RNA的合成和有丝分裂中后期转化至关重要。而在寄生虫领域,特别是血吸虫中,还尚未有文献报道RIO激酶的功能。因此,本课题在实验室建立的分子基础上对Rio2的功能进行了研究。1)日本血吸虫Rio2和Plk1的体外RNA干扰实验由于Rio2为Polo-like激酶Plk1的磷酸化底物,因此使用双链RNA进行了分别干扰Rio2,Plk1和同时干扰这两个基因的体外RNA干扰实验。28天收集的成虫体外干扰9天后,经荧光定量PCR检测获得了对两个基因75%-95%的良好干扰效率。2)对干扰后的表型进行观察对干扰期间的雌虫产卵数进行计数,发现在3-5天、5-7天、7-9天三个阶段各干扰组与对照组均未产生显著性差异;干扰后测量雌雄虫的体长,各干扰组与对照组均未产生显著性差异,说明干扰对血吸虫的产卵过程和生长发育没有显著影响。在干扰培养中加入Ed U标记虫体中正在有丝分裂的细胞,收集样本后在共聚焦显微镜下观察:干扰Plk1后显著抑制了雌雄虫的生殖器官中细胞的有丝分裂,干扰Rio2只轻微抑制了有丝分裂过程,而双干扰与Plk1单干扰的结果类似。说明Rio2对于有丝分裂过程影响不如Plk1显著。使用盐酸卡红染色干扰后的虫体,在共聚焦显微镜下观察形态:干扰Plk1后卵巢和卵黄腺中的细胞数目有所减少,而干扰Rio2后卵黄管中细胞数目增多,雌虫子宫中虫卵增多,双干扰后虫体的表型接近对照组,说明Plk1和Rio2可能起到了相反的功能。3)荧光定量PCR检测干扰后对雌虫中凋亡相关基因的影响在干扰培养后收集雌虫提取RNA反转录为c DNA模板进行荧光定量实验,检测Caspase3,Caspase7和CIAP1三个凋亡相关基因的转录水平,结果发现在干扰Rio2,Plk1和同时干扰这两个基因时均对凋亡基因的转录水平没有明显影响。4)日本血吸虫Rio2多克隆卵黄抗体Ig Y的制备及应用纯化后的Rio2截短蛋白用弗氏佐剂乳化后免疫白色来航蛋鸡,收取鸡蛋提纯卵黄抗体Ig Y,抗体的效价为3200。通过Western blot验证卵黄抗体的免疫反应活性,Rio2的卵黄抗体可以与原核表达蛋白产生特异反应,但未能与日本血吸虫天然蛋白产生免疫反应。本研究成功用双链RNA干扰了血吸虫中的Rio2和Plk1两个基因;分析了RNA干扰对产卵数目、虫体长度、细胞有丝分裂、生殖器官形态等表型的影响及对凋亡相关基因转录水平的影响;制备了针对截短Rio2蛋白的卵黄抗体;这些研究为进一步深入研究RIO激酶在日本血吸虫中的功能奠定了基础。