性逆转时期黄鳝凋亡卵母细胞形态、酶活性及基因表达分析

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangfei871010
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黄鳝是雌雄同体、雌性先熟的性逆转鱼类。性逆转过程中,卵母细胞凋亡的同时,雄性生殖细胞开始发育。为研究黄鳝卵母细胞凋亡过程形态的变化,Caspase家族、Bcl-2家族等相关基因或蛋白的表达规律。本研究统计了四川成都地区黄鳝两周年性腺发育情况,并采用TUNEL检测法、免疫组化检测法和吉姆萨染色法观察了性逆转过程中凋亡卵母细胞的形态特征;同时检测了性逆转过程中凋亡相关酶活性以及基因表达情况,主要研究结果如下。1.2015年4月~2017年3月共采集黄鳝1204尾,体长范围为22.60~51.10cm,体重范围为8.50~153.40g。性体指数(GSI)变化范围为0.39~6.68,其中5月份达到最高,12~3月处于较低水平。两周年的黄鳝总性逆转率为28.77%,性逆转高峰出现在每年的7~8月以及次年的2~3月,高峰时期平均性逆转率为54.60%。在性逆转个体中,性腺重量主要分布在0.20~0.40g之间,间性黄鳝体长主要分布在30.0~40.0cm之间,体重主要分布在20.0~40.0g之间。由此可以看出,四川成都地区黄鳝繁殖高峰期在每年的5月份;性逆转全年发生,在繁殖期前后出现高峰期。2.使用TUNEL染色、Caspase-3免疫组化染色和吉姆萨染色检测了不同发育时期黄鳝性腺中卵母细胞凋亡情况。结果发现,凋亡卵母细胞形态特征表现为细胞皱缩变形,细胞中出现空泡,胞膜皱缩,胞核和胞质界限模糊。TUNEL检测结果的凋亡信号主要位于整个间性时期的初级生长期卵母细胞,间性中期的皮质小泡期卵母细胞和间性早期的卵黄生成期卵母细胞;凋亡卵母细胞形态特征表现为细胞变形,胞质和胞核界限模糊,细胞膜严重皱缩,卵黄颗粒排列稀松散乱。Caspase-3检测结果的凋亡信号主要位于间性时期初级生长期、皮质小泡期和卵黄生成期卵母细胞;凋亡卵母细胞形态特征表现为细胞质皱缩,细胞出现空泡,胞核和胞质界限模糊。吉姆萨染色结果发现凋亡信号主要位于间性时期初级生长期卵母细胞;凋亡卵母细胞形态特征表现为细胞膜裂解,颗粒细胞释放,卵黄颗粒溶解变得散乱。这些结果表明,黄鳝在性逆转时期发生了卵母细胞凋亡,且不同时期卵母细胞凋亡发生起止时间不一致,初级生长期卵母细胞凋亡发生时间贯穿整个性逆转,卵黄生成期卵母细胞凋亡发生于间性早期,皮质小泡期卵母细胞凋亡发生于间性早期和中期。并且凋亡卵母细胞还表现出细胞皱缩变形,细胞中出现空泡,胞膜皱缩,胞核和胞质界限模糊等典型的凋亡形态特征。3.采用双抗体夹心法测定黄鳝不同发育时期性腺Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的酶活性。结果显示,三种酶活性水平呈现先升高后降低趋势,间性晚期三种酶活性显著高于其它各性腺发育时期(P<0.05)。其中,Caspase-3的酶活性在间性早期最低,与其它各发育时期差异不显著(P>0.05)。Caspase-8酶活性在卵黄生成中期最低,与其它各发育时期无显著差异(P>0.05)。Caspase-9在间性早期最低,与其它各发育时期酶活性水平大体一致,且差异不显著(P>0.05)。结果表明,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白酶参与了黄鳝卵母细胞的凋亡过程。间性晚期性腺中3种酶活性呈现相对较高水平,表明其卵母细胞凋亡比例最高。4.运用荧光定量PCR技术检测了caspase-3、bcl-2和bax在黄鳝性腺不同发育时期的表达。结果发现,三个基因在性逆转过程中的表达趋势基本一致。其中,在雌性性腺(卵黄生成中期)中的表达量均显著高于雄性性腺(P<0.05);间性早期和间性中期表达量均高于间性晚期,在其它各发育时期之间差异不显著(P>0.05)。bax和bcl-2的比率在间性晚期为1.0145,大于1。结果表明,caspase-3、bcl-2和bax基因参与了黄鳝卵母细胞凋亡过程,黄鳝性腺间性晚期基因表达处于促进凋亡的水平。综上所述,四川成都地区黄鳝繁殖期相对较早,可能由于春季气温回升较快。四川成都地区黄鳝性逆转全年发生,在夏季末和冬季分别出现两个性逆转高峰,这两个性逆转高峰时间节点分别为繁殖期后和次年性成熟之前。性逆转过程中卵母细胞消失属于凋亡,这可以为性逆转机制的研究和生产上黄鳝性别调控提供依据。
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