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大豆是世界上重要的经济作物之一。培育高油酸大豆品种是大豆育种的重要方向之一。本研究旨在建立高效大豆子叶节再生体系及其农杆菌介导的反义fad基因转化体系,获得高频率的转基因大豆植株,为利用反义RNA技术创新高油酸大豆新种质奠定基础。
本实验以周豆11、S03-1和豫豆29为材料,从大豆种子消毒方法、无菌苗培养方法、大豆基因型和植物激素对子叶节丛生芽分化的影响等方面进行研究,建立了一个高效的大豆器官再生体系:用10%的次氯酸钠消毒大豆种子7 min,用沙培法种子发芽率可达到100%,用0.8mg/L6-BA和0.05 mg/L IBA的激素组合使周豆11号子叶节芽诱导率达95.83%,每个外植体产生2-4个芽。芽在附加0.2mg/L IBA的MS培养基上,发根率可达100%。再生植株移栽成活率91%。在此大豆子叶节再生系统基础上,利用根癌农杆菌LBA4404介导大豆反义油酸脱饱和酶基因fad2-1转化大豆子叶节,研究了农杆菌菌液OD值、预培养时间、感染时共培养时间、恢复培养时间、pH值、乙酰丁香酮的浓度、头孢酶素和卡那霉素等因素对农杆菌转化大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的农杆菌介导反义fad2-1 转化大豆子叶节的体系:子叶节预培养2-3天,根癌农杆菌LBA4404菌液OD在0.6-0.8之间,感染16min,共培养2-3天,恢复培养基上培养3.5天,培养基的pH值在5.4-5.6之间,在感染菌液和共培养培养基中加入100μmol/L乙酰丁香酮,丛生芽筛选培养基含300mg/L头孢霉素和50mg/L卡那霉素,卡那霉素抗性丛生芽诱导率可达30.3%,获得卡那霉素抗性芽51个。这些抗性芽转入含0.2mg/L6-BA和1.0mg/L IBA和50mg/L卡那霉素的生根培养基中生根,获得10个卡那霉素抗性植株,转化率为1.96%。使用35S启动子和nptⅡ基因特异PCR引物对10株抗性转化植株的基因组DNA进行PCR检测,其中2株扩增出了35S启动子和nptⅡ基因的特异带,大小分别为300bp和740bp,证明反义fad2-1基因转入大豆细胞,获得了转基因植株。卡那霉素抗性植株移栽后,置温室培养,生长良好。