目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病的严重并发症。研究DN时蛋白尿的发生发展机制，对于预防DN，以及采取针对性的措施延缓DN的发展，从而提高2型糖尿病患者的生活质量和生活水平有着重要临床和社会意义。　　2型糖尿病时，足细胞之间的裂隙（slit diaphragm，SD）结构消失，足突融合（foot process effacement），最终导致蛋白尿的发生。足细胞裂孔膜上的nephrin、CD2AP，足细胞足突上的α-actin4，足细胞和肾小球基底膜之间的integrinβ1等蛋白分子的丢失都会造成足细胞损伤，导致蛋白尿的发生。　　Krüppel样转录因子（krüppel-like factors，KLFs）属于核转录因子超家族，调节细胞的多种生物过程，包括增殖、分化、生长、发育。近年来的研究发现，KLF4在肾脏的发育和维持其正常生理功能中也具有重要的作用。　　我们在前期的实验中，发现2型糖尿病小鼠肾脏中KLF4的mRNA的表达水平显著下降。结果初步提示，KLF4可能与2型糖尿病肾病的发生有关。阿霉素（adriamycin，ADM）诱导的肾病小鼠的尿蛋白水平显著升高，同时足细胞中，KLF4和nephrin的表达也是显著降低的。相反，增加肾病小鼠足细胞中KLF4的表达又可以升高nephrin的表达，降低尿蛋白水平。那么KLF4表达下降是否与2型糖尿病肾病蛋白尿的发生有关？其机制如何？针对这一问题，本实验以2型糖尿病的db/db小鼠以及高脂环境中的足细胞作为实验对象，研究KLF4在2型糖尿病肾病蛋白尿发生中的作用及其机制，为认识2型糖尿病肾病蛋白尿发生的分子机制提供实验数据。　　方法：　　1.实验动物　　采用db/db小鼠作为2型糖尿病动物模型，用尾静脉注射过表达KLF4腺病毒（Ad-GFP-KLF4）的方法改变db/db小鼠肾内KLF4的表达水平。　　2.细胞株　　条件性永生化小鼠足细胞。用棕榈酸（C16:0）模拟2型糖尿病的高脂环境。用过表达KLF4腺病毒感染足细胞，改变KLF4的表达水平。　　3.标本收集　　分别于第8周、12周、16周收集尿液并取肾脏组织。肾脏组织分别用于Western blot、PCR、 PAS染色、免疫组化实验等。　　4.细胞收集　　对数生长期足细胞经相应浓度 BSA、C16:0、C16:0+Ad-GFP、C16:0+Ad-GFP-KLF4处理48小时后，收集细胞进行Western blot及PCR分析实验。　　5.Lowrry法测定小鼠24小时尿蛋白总量。　　6.实时定量PCR检测KLF4在2型糖尿病小鼠肾脏中的mRNA表达水平，检测nephrin和integrinβ1在高脂环境小鼠足细胞的mRNA表达水平。　　7.Western blot检测KLF4在2型糖尿病小鼠肾脏中的蛋白表达水平，以及KLF4、nephrin、α-actin4和integrinβ1在高脂环境小鼠足细胞的蛋白表达水平。　　8.PAS染色观察小鼠肾脏肾小球结构　　9.免疫组织化学分析2型糖尿病小鼠肾小球中nephrin、CD2AP、α-actin4、integrinβ1和integrinα3的蛋白表达水平。　　10.数据处理　　采用SPSS17.0软件进行统计学处理分析，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，数据用x±SD表示，两组间比较用双尾-T检验分析。P<0.05为差异有显著性意义。　　结果：　　1. KLF4在db/db小鼠肾小球中表达下降　　1.1.2型糖尿病小鼠的尿蛋白水平　　与同周龄的对照组db/m小鼠（8周：5037.34±1037.73μg/24h；12周：2649.32±87.07μg/24h；16周：34605.02±16160.58μg/24h）相比，db/db小鼠在第8周（4777.18±1378.49μg/24h）时尿蛋白水平没有明显的变化，但随着周龄的增加，在第12周（18629.52±3885.96μg/24h，P＜0.01）和第16周（323798.60±67766.10μg/24h，P＜0.01）尿蛋白水平逐渐增高，显著高于对照组。　　1.2.KLF4在肾小球中的表达水平　　PCR的结果显示，与对照组db/m小鼠相比， db/db小鼠肾皮质中KLF4的mRNA表达水平显著下降。Western blot的结果显示，与对照组db/m小鼠相比，db/db小鼠肾皮质中KLF4蛋白表达水平显著下降。免疫组化的结果显示，与对照组db/m小鼠（275.50±30.26）相比，db/db小鼠（150.25±15.97，P＜0.01）肾小球中KLF4表达水平显著下降。　　以上结果提示，肾小球KLF4表达下降可能与2型糖尿病肾病蛋白尿的发生有关。　　2.肾小球过表达KLF4后，db/db小鼠的尿蛋白水平显著降低　　2.1.KLF4在肾小球中的表达水平　　免疫组化的结果显示，与无过表达KLF4的db/db小鼠（152.25±12.89）相比，过表达KLF4的db/db小鼠肾小球中KLF4表达水平（317.5±33.25，P＜0.01）显著上调。　　2.2.肾小球过表达KLF4后，db/db小鼠的尿蛋白水平　　过表达KLF4后，db/db小鼠尿蛋白水平（264330.80±33824.15μg/24h， P＜0.05）较无过表达KLF4的对照组（435255.6±10446.17μg/24h）明显降低。　　以上结果说明，肾小球KLF4表达下降，是2型糖尿病肾病蛋白尿发生的原因之一，增加KLF4的表达能够改善2型糖尿病肾病尿蛋白。　　3.KLF4可通过增加db/db小鼠肾小球中nephrin、integrinβ1和α-actin4的表达来改善2型糖尿病肾病的尿蛋白水平　　3.1.2型糖尿病小鼠肾小球的结构　　PAS染色结果显示db/db小鼠与对照组db/m小鼠的肾小球结构没有明显差异。　　3.2.肾小球蛋白滤过屏障关键蛋白， nephrin、integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP的表达水平　　免疫组化的结果显示，除CD2AP和integrinα3外，db/db小鼠肾小球中nephrin（0.148±0.003，P＜0.01）、integrinβ1（0.109±0.009，P＜0.05）和α-actin4（0.136±0.001，P＜0.05）的表达水平均显著低于对照组db/m小鼠（nephrin：0.208±0.016；integrinβ1：0.180±0.008；α-actin4：0.159±0.007）；当db/db小鼠过表达KLF4后，肾小球中nephrin（0.178±0.006， P＜0.01）、integrinβ1（0.164±0.006，P＜0.01）和α-actin4（0.156±0.006， P＜0.05）的表达水平显著高于无过表达KLF4的db/db小鼠（nephrin：0.148±0.003；integrinβ1：0.109±0.009；α-actin4：0.136±0.001）。　　与文献报道相符，integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP在肾小管中也有表达。与对照组db/m小鼠相比，db/db小鼠肾小管中α-actin4的表达较低，integrinβ1、integrinα3、和CD2AP的表达无明显的差异；db/db小鼠过表达KLF4后，肾小管中integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP的表达无明显的变化。nephrin特异性表达在肾小球中，但在本实验中，在肾小管中也有少量阳性颗粒，可能是因为实验条件不够优化所致。　　以上结果说明，2型糖尿病小鼠肾小球中nephrin、integrinβ1和α-actin4的表达水平与KLF4的表达水平有关，低表达水平的KLF4有可能通过影响nephrin、integrinβ1和α-actin4的表达下降而与2型糖尿病肾病蛋白尿的发生相关联。另外，2型糖尿病肾病蛋白尿的发生可能还与肾小管中α-actin4的表达下降有关。　　4.在高脂环境的足细胞中，KLF4可以调节nephrin、integrinβ1的表达　　在不同浓度的C16:0环境下，足细胞中KLF4呈浓度依赖性下降。并且发现，足细胞在C16:0浓度为250μM的高脂环境中48小时后，伴随着KLF4的下降， nephrin和integrinβ1蛋白表达水平均显著下降，而α-actin4的蛋白表达水平没有明显的变化；对高脂环境的足细胞过表达KLF4后，nephrin的mRNA和蛋白表达水平显著升高；integrinβ1的mRNA表达水平无明显的变化，蛋白表达水平显著升高。此结果说明，在高脂环境的足细胞中，KLF4很可能从转录水平调节了nephrin的表达，进而上调了蛋白的表达；从尚未知的途径只影响了integrinβ1的蛋白表达。　　以上结果说明，2型糖尿病肾病蛋白尿的发生与KLF4表达减少有关。其可能机制：（1）与足细胞中低水平KLF4转录调节nephrin的表达下降有关；（2）与足细胞中低水平KLF4通过未知途径使integrinβ1表达下降有关。　　结论：　　足细胞中KLF4表达下降，进而使nephrin表达降低，导致了2型糖尿病肾病蛋白尿的发生。上调足细胞中KLF4的表达，可以减少蛋白尿。