研究背景和目的：结直肠癌是全球高发的恶性肿瘤之一。全球每年新发病例已增至100万,其发病率正以4.2%的速度螺旋递增。结直肠癌病因尚未明确,早期无明显症状,容易发生转移,这些是导致其预后差,病死率居高不下的重要因素。因此,加强结直肠癌发生发展及转移机制的基础研究,寻找预防和治疗的有效途径,是结直肠癌研究的重要内容。结直肠癌发生与发展是一个多基因参与、多因素相互作用、经过多个阶段最终形成的、极其复杂的生物学现象。癌基因和抑癌基因的发现,细胞信号传导通路的阐明,极大地丰富了人们对细胞癌变机制的认识。其中,APC和MCC基因突变、MMR基因失活、K-ras基因突变、抑癌基因DCC缺失、抑癌基因p53的突变与缺失等系列改变分子遗传学模式是大肠癌发生的经典分子遗传学模式。Wnt信号途径是一类在生物体进化过程中高度保守的信号转导途径,调节控制着众多生命活动过程。在胚胎发育过程中,它不但决定着细胞的生长、分化,同时也调节着诸如心血管、中枢神经等重要器官的分化和形成；而在成体内,wnt信号途径直接控制着增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等细胞命运。Wnt信号通路的失调已被证实与多种肿瘤发生密切相关,在目前已知的癌症中,宫颈癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤、胶质瘤等十几种高发性癌变源于Wnt信号转导途径的失调。当wnt信号通路发生异常时,引起胞内p-连锁蛋白(β-Catenin)积累,游离的β-Catenin可进入细胞核,调控下游基因表达,从而促进肿瘤发生。已有报道证实,异常的Wnt信号通路是90%大肠癌的早期进展事件。HOXB7属同源异型盒基因HOX家族。同源盒基因(homeoboxgene)首先在果蝇体内发现,是在包括人在内的动物的胚胎发育和细胞分化中发挥重要作用的一类基因,许多证据显示HOX基因表达紊乱可能在包括肿瘤在内的疾病中发挥重要作用；目前已知其在黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、前列腺癌、等肿瘤中有异常表达,且与肿瘤的分级、分化有关。近年来,多个研究对HOXB7在肿瘤中的作用进行了分析,发现HOXB7在肿瘤细胞的增殖、运动和侵袭中起到重要作用,并且其表达情况与临床病理特征密切相关(癌组织高于正常组织,转移或预后差病例更高)。本实验室长期从事结直肠癌转移的分子机制研究,为了寻找标志结直肠癌进展和转移的特异性分子标志物,阐明结直肠癌发生、侵袭、转移的分子机制,我们利用具有相同遗传背景,不同转移潜能的结直肠癌细胞株(SW480、SW620)进行Affymetrix全基因组表达芯片分析,发现同源异形盒基因HOXB7在高转移潜能细胞中表达升高。本课题组在前期实验中对HOXB7在结直肠癌细胞和组织中的表达及其生物学功能进行了初步探讨,发现HOXB7在结直肠癌细胞株中均有不同程度的表达,其在高转移潜能的细胞株表达水平高于低转移潜能的细胞株。研究224例结直肠癌患者HOXB7表达水平与临床病理因素的关系,发现HOXB7与结直肠癌组织的Duke’s分期、T分期、远处转移及Ki-67呈正相关,HOXB7高表达提示预后差；进一步采用体内外实验研究HOXB7的生物学功能,结果表明,HOXB7能促进结直肠癌细胞株的生长增殖及成瘤能力,根据上述实验结果,我们推测HOXB7不仅调控结直肠癌的生长和增殖,还可能影响结直肠癌的侵袭和转移过程。由于HOXB7促进肿瘤发生发展的机制尚未明确,我们采用慢病毒感染的方法构建了稳定过表达HOXB7的结肠癌细胞株(SW480/HOXB7)及对照细胞株(SW480/vector),应用Roche-NimbleGen全基因组表达芯片分析,发现过表达HOXB7组的Wnt信号通路活性明显高于对照组。接下来我们采用蛋白质免疫共沉淀(CO-IP)和比较蛋白组学技术分析SW480/HOXB7及SW480/vector这两株细胞的蛋白裂解液,发现HOXB7可以与β-Catenin靶向结合。这些重要的现象提示我们,HOXB7可能与β-Catenin及Wnt信号通路存在密切联系。本课题通过探讨HOXB7与β-Catenin及Wnt信号通路三者的关系,深入认识结直肠癌发生发展机制,而且还将为结直肠癌的治疗提供新的思路和理论依据。方法1.采用慢病毒感染的方法构建稳定过表达HOXB7的细胞株(SW480/HOXB7)和对照细胞株(SW480/vector), Roche全基因组表达芯片分析这两对细胞株的差异；应用蛋白质免疫共沉淀(CO-IP)和比较蛋白组学质谱技术分析SW480/HOXB7及SW480/Plncx2这两株细胞的蛋白裂解液,检测这两对细胞株之间的差异蛋白。2.用免疫组织化学技术检测100例结直肠癌患者病理标本中HOXB7与β-Catenin的表达情况；采用慢病毒感染的方法构建稳定过表达HOXB7的细胞株(293FT/HOXB7)和对照细胞株(293FT/vector)及稳定敲除HOXB7的细胞株(SW620/shHOXB7、HCT15/shHOXB7)和对照细胞株(SW620/scramble、 HCT15/scramble),激光扫描共聚焦显微镜在(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7、 S W620/shHOXB7、HCT15/shHOXB7)和对照细胞株(SW480/vector、293FT/vector SW620/scramble、HCT15/scramble)中观察HOXB7与β-Catenin的共定位情况；采用荧光定量PCR及Western blot实验分析β-Catenin表达是否与HOXB7表达相一致,并利用核浆分离实验鉴定二者相互作用的部位。3.构建带FLAG标签的HOXB7的突变体HOXB7M1-HOXB7M4,构建带HA标签的β-Catenin的突变体β-CateninM1-β-CateninM7,采用蛋白质免疫共沉淀(CO-IP)及免疫荧光技术分别检测β-Catenin与HOXB7相互作用的区域位置。用染色体免疫共沉淀(CHIP)技术分析HOXB7与β-Catenin相互促进入核并定位到TCF4/LEF1启动子区域的机制。4.用TOP FLASH/FOP FLASH双荧光素酶报告系统检测稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7)的细胞株和对照细胞株(SW480/Plncx2、293FT/Plncx2)以及稳定干扰HOXB7的细胞株(HCT15/shHOXB7和HCT116/HOXB7)和(HCT15/Scramble和HCT116/Scramble)中的Wnt信号通路活性,并在上述细胞株中用Western blot和Real-time PCR检测Wnt信号通路下游靶基因DKK1、LEF1及CyclinD1的表达情况；western blot技术及免疫荧光染色检测OCT-4、SOX-2、CD133和CD44等干细胞标志的表达情况；SP流式分选技术检测稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7)的细胞株和对照细胞株(SW480/vector、293FT/vector)以及稳定干扰HOXB7的细胞株(HCT15/shHOXB7和HCT116/HOXB7)和(HCT15/Scramble和HCT116/Scramble)中的SP侧群细胞比例；SW480细胞株中瞬时转染vector、 HOXB7、HOXB7-scramble、HOXB7-sh-β-catnin质粒,TOP FLASH/FOP FLASH双荧光素酶报告系统检测这四组细胞株Wnt信号通路活性,Migration小室侵袭实验检测这四组细胞的侵袭能力,SP流式分选技术检测这四组细胞株SP侧群细胞数目。结果1.利用基因芯片和比较蛋白组学技术分析HOXB7在结直肠癌增殖、侵袭和转移中的作用用慢病毒感染的方法将HOXB7和vector稳定表达于结直肠癌细胞株SW480中,经嘌呤霉素筛选并鉴定,得到稳定表达HOXB7的细胞株(SW480/HOXB7)及对照细胞株(SW480/vector)。利用Roche-NimbleGen公司的寡核苷酸芯片(47400个转录本,包含38500个已知基因)分析检测HOXB7过表达后差异基因表达谱。应用Gene Ontology、MILANO、Panther、Genomatix等软件进行生物信息学分析。利用蛋白质免疫共沉淀技术CO-IP及蛋白质组学技术分离(SW480/HOXB7)及对照细胞株(SW480/vector)的总蛋白,建立重复性和分辨率较好的SDS-PAGE电泳图谱,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质点。利用Matrixscience公司的在线软件Mascot Distiller进行分析,发现稳定过表达HOXB7后可以与β-Catenin直接结合并激活Wnt信号通路。2. HOXB7对P-Catenin的调控对100例结直肠癌患者病理标本进行免疫组化检测HOXB7与β-Catenin表达情况,发现HOXB7在8例样本中表达较弱,33例样本中呈中度表达,在59例样本中呈高度表达,β-Catenin与HOXB7的表达情况很一致,它在7例样本中表达较弱,30例样本中呈中度表达,在53例样本中表达很强,而且它们在组织中表达强度、表达部位也非常相似。用激光扫描共聚焦显微镜在稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7)和对照细胞株(SW480/Plncx2、293FT/Plncx2)及稳定干扰HOXB7的细胞株(HCT15/shHOXB7和SW620/shHOXB7)和(HCT15/Scramble和SW620/Scramble)发现HOXB7与β-Catenin在细胞浆与细胞核中有共定位情况,并且β-Catenin会随着HOXB7表达的上升(下调)而上升(下调)。荧光定量PCR及western blot的结果也说明β-Catenin与HOXB7的变化相一致。3. HOXB7与P-Catenin作用机制的探索SW480细胞中瞬时共转染带FLAG标签的HOXB7及带HA标签的β-Catenin质粒,应用CO-IP技术,以FLAG抗体沉淀HOXB7蛋白,Western blot技术可以检测到带HA标签的β-Catenin蛋白。分别将稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7)和对照组(SW480/vector、293FT/vector)的细胞株进行核浆蛋白分离,应用蛋白质免疫共沉淀CO-IP技术分别检测其细胞浆和细胞核,发现HOXB7与β-Catenin在细胞核可以结合。应用蛋白质免疫共沉淀CO-IP技术,检测到全长的β-Catenin可以与HOXB7M1、HOXB7M3和HOXB7M4结合,同时采用激光扫描共聚焦显微镜检测稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7)和对照细胞株(SW480/Plncx2)中,全长β-Catenin与HOXB7M1、HOXB7M3、HOXB7M4在细胞核均出现共定位现象,而HOXB7M2与P-Catenin则没有结合及共定位现象,HOXB7M2是同源序列区缺失的突变体。提示我们β-Catenin主要与HOXB7的同源序列区域发生反应；我们继续利用CO-IP技术,检测到全长的HOXB7可以与β-Catenin的M3、M5及M6发生结合反应,这四个突变体对应于β-Catenin的11-12重复手臂区域,说明HOXB7与β-Catenin结合的部位主要在11-12重复手臂区域。应用染色体免疫共沉淀技术CHIP检测HOXB7与β-Catenin的入核机制,发现HOXB7与β-Catenin需要相互依赖并进入细胞核,同时定位到TCF4/LEF1启动子区域。免疫荧光染色发现HOXB7、β-Catenin与TCF4可以在细胞核共定位。4. HOXB7影响Wnnt信号通路的活性及下游的靶基因采用TOP FLASH/FOP FLASH双荧光素酶报告系统检测稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7)的细胞株和对照细胞株(SW480/vector、293FT/vector)的荧光素酶活性以及在稳定干扰HOXB7的细胞株(HCT15/shHOXB7和SW620/shHOXB7)和对照细胞株(HCT15/Scramble和SW620/Scramble)发现过表达HOXB7细胞株的Wnt信号通路明显增高,而HOXB7被敲除后的wnt信号通路活性出现下降。Western blot、Real-time PCR检测稳定过表达HOXB7(SW480/HOXB7、293FT/HOXB7)的细胞株和对照细胞株(SW480/vector、293FT/vector)以及稳定干扰HOXB7的细胞株(HCT15/shHOXB7和SW620/shHOXB7)和对照细胞株(HCT15/Scramble和SW620/Scramble)中DKK1、LEF1及CyclinD1表达情况,发现过表达HOXB7细胞株的DKK1、LEF1及CyclinD1表达明显增高,而HOXB7被敲除后,它们的表达出现下调。免疫荧光检测,发现过表达HOXB7细胞株的干细胞标志物OCT-4、SOX-2、CD133和CD44的表达显著高于对照组。同时HOXB7被干扰的细胞株中干细胞标志物OCT-4、SOX-2、CD133和CD44表达出现下降。SW480细胞株中瞬时转染vector、HOXB7、HOXB7-scramble、HOXB7-sh-β-catnin质粒,采用TOP FLASH/FOP FLASH双荧光素酶报告系统检测这四组细胞株Wnt信号通路活性,发现β-Catenin被干扰后,细胞的Wnt信号通路活性会下降；同时利用migration小室侵袭实验检测这四组细胞的侵袭能力,发现β-Catenin被干扰后细胞株的侵袭能力显著下降；最后利用SP流式分选技术检测这四组细胞株SP侧群细胞数目,发现β-Catenin干扰组的SP侧群细胞数目也明显减少。结论1. HOXB7与β-Catenin及wnt信号通路有着密切的关系；HOXB7可以通过结合β-Catenin,促进β-Catenin入核,激活经典的Wnt信号通路。2. HOXB7与β-Catenin作用位点主要在其同源序列区域,而β-Catenin与HOXB7作用的位点主要位于重复手臂序列的11-12区域,这些区域的缺失或突变有可能干扰β-Catenin入核,抑制Wnt信号通路的激活,可以为结直肠癌的治疗提供一个新的理论依据和靶点。3. HOXB7可以与β-Catenin相互作用进入细胞核,定位于TCF4/LEF1启动子区域,从而对增殖、侵袭迁移相关基因进行调控,最后影响结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移及转移能力。本研究的创新之处1.建立了稳定外源性高表达HOXB7和稳定干扰沉默内源性HOXB7的结直肠癌细胞株；2.将基因组芯片和比较蛋白组学技术相结合,实现了转录组和蛋白质组的对接；3.染色体免疫共沉淀及蛋白质免疫共沉淀技术,综合分析HOXB7基因在结直肠癌转移中的作用,研究设计科学,为结直肠癌的转移机制研究提供新方法和新思路；4.揭示了HOXB7基因促进结直肠癌增殖,转移的新机制