结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，2000年世界癌症流行趋势分析表明，全球结、直肠癌发病率居恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位。近些年来我国大肠癌发病率的上升趋势亦十分明显。其中城市结肠癌的发病率以4％的年增长率递增，而男性结肠癌患者增加了58.8％。由于其临床表现常较隐匿且缺乏特异性，难以早期发现，许多患者就诊时已属于中晚期且大多数有淋巴结转移。虽然，在200多年前有研究工作者认识到肿瘤淋巴结转移是肿瘤的预后因素之一，但其确切的机制不是很清楚，因此，阐明肿瘤淋巴结转移机制有助于肿瘤患者的预后以及选择正确的治疗方法。淋巴管形成促进了肿瘤淋巴结的转移，VEGF-C是目前己知的促淋巴管生长因子，属于血管内皮生长因子(VEGF)家族成员之一，据文献报道在甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌中VEGF-c表达与肿瘤新生淋巴管形成及淋巴结转移有关。肿瘤细胞产生的VEGF-C与其淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3结合刺激淋巴管的生成和促进淋巴结的转移，VEGF-C表达增高通过增加肿瘤细胞与淋巴管内皮细胞的接触面积、增加管腔的通透性、改变淋巴管内皮细胞黏附性或黏附分子的表达使肿瘤浸润转移的能力增强。实验研究表明VEGF-C/VEGFR-3信号传导在诱导淋巴管过程中起着重要作用，阻断该信号通路是抗淋巴管生成治疗目前最常用的策略；用于阻断VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-3相互作用的主要方法包括单克隆抗体、可溶性VEGFR-3-Ig、小分子肽抑制剂、前蛋白转化酶(PCs)抑制剂、基因治疗等。 RAN干扰(RNAi)技术是近年来发展起来的一项特异性抑制基因表达的新方法，它利用了由于小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻断mRNA的翻译，它普遍存在各种生物，是一种集快捷、高效、特异性强于一体的抑制基因表达的技术手段，可广泛用于基因功能测定及基因治疗等方面。 基因治疗的载体问题以及载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性问题成为基因治疗和临床应用的瓶颈。目前，基因治疗常用的载体系统主要包括两大类：病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体系统有慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体等，是目前基因治疗研究中最常用的一类载体。腺病毒不能稳定整合于宿主细胞基因组内，故难以长期稳定表达，甚至可能引起机体强烈的免疫反应：腺相关病毒载体容量小，难以为大片断基因所利用，且制备困难；使得从逆转录病毒到腺病毒载体的安全性受到质疑，研究者的目光亦从病毒载体转移到非病毒载体上。传统的非病毒载体如脂质体、肽类化合物、阳离子聚合物等，虽然安全，但基因传递效率极低，难以获得有意义的基因表达。因此，进一步开发安全、有效并具有优良特性的非病毒基因转运载体系统是发展基因治疗的当务之急。近年来发展起来的一种新型非病毒基因转运载体-纳米粒基因转运载体有望突破这一瓶颈，使基因治疗发展成为临床常规治疗手段。纳米颗粒因为具有小尺寸效应，表面效应，随着颗粒直径变小，比表面积将会显著增大，故具有很高的化学活性，因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。研究表明，纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒，在短时间内，不会很快被吞噬细胞清除，从而更多的渗出到血管外、组织间隙，延长与细胞的接触时间，提高转染效率；通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解，但纳米基因载体有浓缩，保护DNA功能，与DNA形成一致密的结构，使DNA不被核酸酶消化降解。 目的：用化学方法构建一种新型非病毒转基因载体-碳酸钙纳米，并以此载体转染表达载体质粒pGenesil-siRNA-VEGF-C，通过体外实验和裸鼠体内实验了解质粒pGenesil-siRNA-VEGF-C能否特异性干扰大肠癌细胞株LOVO细胞中VEGF-C基因的表达以及能否影响裸鼠移植瘤中淋巴管的生成以及局部淋巴结的转移。 方法： 1.利用氯化钙与碳酸钠反应生成碳酸钙的原理制备新型非病毒转基因载体-碳酸钙纳米；利用zetasize DELSA-400检测碳酸钙纳米粒径表面电荷和透射电子显微镜检测碳酸钙纳米粒径大小，通过琼脂糖凝胶实验检测碳酸钙纳米对DNA的结合和保护的最佳比例，并用流式细胞仪、MTT实验检测其转染效率及其对细胞的毒性。 2.采用Western blot、RT-PCR技术，在蛋白质和mRNA水平检测VEGF-C基因在不同消化道肿瘤细胞株中的表达。 3.利用计算机在线软件设计针对VEGF-C基因特定序列的寡核苷酸片断，并将其定向克隆入真核表达载体，成功构建重组质粒pGenesil-siRNA-VEGF-C1、pGenesil-siRNA-VEGF-C2、pGenesil-siRNA-VEGF-C3和阴性对照质粒pGenesil-siRNA-HK。 4.用碳酸钙纳米将构建的真核表达质粒转染入大肠癌细胞株LOVO细胞，应用实时荧光定量PCR、Westren blot技术检测VEGF-CmRNA和蛋白表达变化的情况，用MTT检测其对细胞增殖抑制情况。 5.建立裸鼠移植瘤模型，进行瘤内注射质粒，每3天一次，共8次，4周后处死裸鼠测肿瘤重量，并绘制肿瘤生长曲线，免疫组化和Western blot技术检测肿瘤组织VEGF-C蛋白表达变化情况，免疫组化染色计数移植瘤组织中微淋巴管和微血管的密度，并计算移植瘤细胞的凋亡指数。 结果： 1.成功制备了一种新型的非病毒转基因载体-碳酸钙纳米，其表面电荷为28.6mv，粒径为58nm，与DNA结合的最佳比例为15:1，转染效率为53.38％。 2.三株细胞均有VEGF-C表达，LOVO、SW-620、SGC-7901中VEGF-C蛋白的表达量分别是0.52±0.03，0.34±0.02， 0.31±0.03，LOVO细胞株中VEGF-C的蛋白量与SW-620、SGC-790l细胞株中VEGF-C蛋白量比较差别有显著性SGC-7901、LOVO、SW-620中VEGF-C mRNA的表达量分别是0.27±0.03、0.64±0.04、0.30±0.02，LOVO细胞株中VEGF-CmRNA的表达量最高。与其它两株细胞相比差别有显著性。 2.经酶切和测序分析证实成功构建了真对VEGF-C基因小分子RNA干扰表达载体质粒。 3.重组质粒pGeneesil-shRNA-VEGF-C1、pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C2、pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C3用碳酸钙纳米转染入LOVO细胞三天后，蛋白表达抑制率分别为4.330％，35.437％，34.710％；mRNA的抑制率分别为3.079％，45.545％，43.178％。 4.重组质粒pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C2能够抑制移植瘤内微淋巴管和微血管的生成，能够抑制肿瘤的生长和局部淋巴结的转移。 结论: (1)碳酸钙纳米可能成为一种新型的非病毒基因转染载体. (2)体内和体外实验均表明RNAi表达载体对VEGF-C基因的抑制效果具有特异性和高效性，抑制效果可以持续4周以上，有望成为抗大肠癌淋巴管生成和淋巴结转移的治疗方法之一。