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醋糟是酿醋行业产生的有机废弃物,处理难度大。为将醋糟开发成动物饲料,必须降低粗纤维含量。枯草芽孢杆菌是益生菌,可以分泌纤维素酶,但其缺少外切纤维素酶,对醋糟纤维素结晶区不起作用。为了获得高效降解醋糟纤维素的枯草芽孢杆菌,本文利用分子生物学技术,构建了组成型表达载体pGAR,获取外切纤维素酶CelO基因片段,克隆到质粒pGAR中,将得到的重组质粒pGARO导入枯草芽孢杆菌DB403中,获得重组外切纤维素酶枯草芽孢杆菌DB403(pGARO),并初步研究了其在醋糟固态发酵时的条件。得到以下研究结果:
(1)构建组成型穿梭表达载体pGAR。分别抽提大肠杆菌.枯草芽孢杆菌穿梭质粒pGJ148和枯草芽孢杆菌质粒pUBH,以pUBH为模板,扩增枯草杆菌碱性蛋白酶(Apr)分泌表达的调控元件AR,克隆到pGJ148穿梭质粒中。试验结果表明,组成型穿梭表达载体pGAR构建成功。
(2)外切纤维素酶CelO基因的克隆。厌氧培养热纤梭菌,抽提基因组,PCR扩增外切纤维素酶CelO基因片段,克隆于pGAR表达载体中AR基因片段下游。试验结果表明,成功构建了携有CelO基因的枯草芽孢杆菌表达载体pGARO。
(3)重组菌DB403(pGARO)的构建和表达检测。将质粒pGARO通过化学方法转化到枯草芽孢杆菌宿主菌DB403中,获得具有外切纤维素酶CelO基因的枯草芽孢杆菌重组菌DB403(pGARO);经过SDS-PAGE鉴定,外切纤维素酶CelO成功表达;通过在基础产酶培养基和醋糟液体培养基中发酵,测得滤纸酶活均高于宿主菌DB403,确定重组菌DB403(pGARO)表达的CelO具有活性。
(4)固态发酵醋糟条件优化与验证。为了获得最佳产酶发酵条件,以纤维素滤纸酶活为测定指标,进行了单因素和正交试验,并对最佳产酶条件进行了验证试验。通过对单因素和正交试验结果的分析,确立了最佳酶活发酵条件;通过方差分析得知,尿素添加量和发酵温度对产酶影响极其显著(P＜0.01),接种量和水料比对产酶影响显著(P＜0.05):最佳产酶发酵条件下,测得重组菌DB403(pGARO)酶活达到290U/g,醋糟固态发酵7天后,纤维素降解率达到16%以上,是野生型B1组的1.6倍。