近几年,随着生物技术的迅速发展,越来越多的物种基因组测序工作也相继完成,基因功能研究作为后基因时代的主要任务,在该领域不断向前推进的同时,相关的技术手段取得了长足的发展。其中,基因组定点编辑技术,可为基因功能研究提供基因敲除的突变体材料,是理想的基因功能研究方法。基因组定点编辑技术包括:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFNs)、转录激活类效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALENs)和 CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated system 9)。ZFNs是最先被发展的基因定点编辑技术,由于ZFNs设计和筛选十分困难,并且脱靶效应往往会造成细胞毒害,这些因素使其应用受到限制。后来,基因编辑技术发展出新的技术,即转录激活类效应因子核酸酶(TALENs),在理论上可以获得任意靶位点的序列,但是该体系的组装和筛选需要大量的测序工作,花费较高。目前,基因编辑技术CRISPR/Cas9作为一种新的基因组定点编辑技术逐渐被应用于动植物的基因敲除,该系统基因操作效率高、方法简便,在大大降低脱靶效应的同时还能保证高效、特异的位点切割。以上三种方法在导致基因双链断裂后激活自身的损伤基因修复机制:同源重组修复和非同源末端连接修复,介导基因序列的插入、缺失或置换,引起基因突变。本研究主要通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,对拟南芥eIF2α基因和玉米HLH、BRD基因进行编辑,获得目的基因突变体,进而研究基因功能。同时,构建和优化CRISPR/Cas9的玉米表达载体,为玉米的转基因与进一步的基因功能研究奠定基础。在拟南芥中,eIF2α蛋白激酶在响应逆境胁迫时起着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术对目的基因eIF2α家族的两个成员进行定点敲除。本课题组对该基因家族的两个成员分别按照PAM原则设计了特异的gRNA(Guided RNA),序列长度为20bp,分别识别at2g40290、at5g05470两个基因的特异靶位点,并将这两个gRNA命名为2gⅡ-gRNA、5gⅢ-gRNA。对两基因家族成员进行了序列分析,发现有一段20bp长度的高度保守同源序列,3’端符合NGG的结构,以该序列为靶基因识别序列设计gRNA,我们将其命名为gI-gRNA,以达到在同一植株体内同时敲除两个基因的目的。但5’端没有C或G,试验实际操作过程中合成gRNA引物时人为在5’端加了一个碱基G,保证gRNA的稳定性。将合成的gRNA引物与Cas9载体及1300载体依次连接,获得3个完整的CRISPR/Cas9系统。通过农杆菌介导的花序侵染法获得转化拟南芥植株,利用抗生素和基因型鉴定分别筛选到gI-gRNA、2gⅡ-gRNA、5gⅢ-gRNA 的阳性突变体。在玉米中,有研究报告显示,玉米叶夹角的大小对生物产量有着直接影响,并且该性状受基因HLH和BRD的调控。本研究对CRISPR/Cas9原始载体启动子和终止子针对玉米的转基因进行了优化,ZmU3启动子启动gRNA的表达,而Cas9的启动子和终止子由原来的pAtUBQ和tAtUBQ替换成了 pOsUBQ和OCS,以提高在玉米中的表达。靶基因选择HLH和BRD两个叶夹角相关基因,进行gRNA的设计和CRISPR/Cas9载体的构建。除此之外,为了使载体能够融合多个基因的gRNA,我们对载体的多克隆位点进行了优化改造,添加了 PmeI、PacI、SmaI、XmaI、以及SwaI五个限制性内切酶的识别剪切位点。可以有效的将两个不同的特异gRNA融合到一个CRISPR/Cas9系统中,提供基因编辑效率,缩短突变体的筛选时间。另外,我们还优化改造出35S启动子和OCS终止子引导Cas9蛋白翻译,AtU6启动gRNA的表达载体,有望用于小麦的转化。