肿瘤的发生是多基因突变累积的结果，一般认为遗传不稳定是造成基因突变不断累积的基础。“突变表型假说”(mutator phenotype hypothesis)认为，在癌变早期，如果一个遗传稳定相关基因突变失活，使参与多阶段癌变(multistage carcinogenesis)的其它基因突变率上升，导致突变不断累积，引起突变细胞过度增生而发生肿瘤。DNA复制或修复的效率和保真度是影响遗传稳定性的关键因素。DNA聚合酶基因突变引起DNA合成保真度降低与肿瘤发生有一定关系。随着一批新的DNA聚合酶的发现，DNA聚合酶与肿瘤发生的关系研究成为更大的挑战。 细胞经常遭受体内外的基因毒性物质(genotoxin)的攻击，如活性氧(reactive oxygen species，ROS)和紫外线或者环境中多环芳烃等，造成各种DNA损伤，这些损伤通常被原核或真核生物体内的各种修复机制所修复。然而修复机制并不完善，持续存在DNA损伤将阻碍DNA复制，不利于细胞生存。DNA跨损伤合成机制使细胞能够避免因复制停止而引起的死亡。最近几年陆续出现了一批参与跨损伤合成的DNA聚合酶，称为特殊化DNA聚合酶(specialized DNA polymerase)，DNA聚合酶kappa(pol κ)就是其中之一。 人pol κ与大肠杆菌DinB同源，DinB编码大肠杆菌DNA聚合酶Ⅳ，是λ噬菌体非定标突变所必须的SOS蛋白。1999年，Gerlach等通过筛选Hela细胞cDNA文库克隆了人pol κ的基因，荧光原位杂交技术将基因定位在5q13.1。根据cDNA序列推测pol κ(蛋白含有870个氨基酸，N端有保守的核苷转移酶结构域，2个与DNA结合的HhH(helix-hairpin-helix)结构域，以及C端有2个锌指样结构。Northern blot发现pol κ的5.0kb的转录产物在组织中表达水平高低不一。实验表明，pol κ能跨越多种DNA损伤，包括1，N~6-乙烯脱氧腺苷(ethenodeoxyadenosine)或乙酰胺基芴(acetylaminofluorene，AAF)修饰的鸟嘌呤加成物，导致碱基置换或缺失；在8-oxo-2-deoxyguanosine对面插入dAMP，以无碱基位点下游的碱基为模 浙江大学博士学位论文板插入配对碱基，造成上移码突变。对某些损伤，pci O不能进行TLS，包括顺铂加成物，胸腺啼陡H二聚体等，但是能有效延伸错配的引物末端。pci I＜能够对B（刀造成的DNA损伤进行TLS，在G对面插入C，准确跨越4种不同构象的dG－NZEPDE。尽管如此，大多数情况下 p＊。主要产生突变。p＊ 在肺癌中高表达，提示＊。与肿瘤发生的相关性。小鼠p。在睾丸组织中表达随发育过程而变化，它的转录受 AhR调控。有关p。在肿瘤中差异表达的机制还不清楚。通过本课题的研究，试图阐明p。的转录调控机制，有助于我们深入了解p。在肿瘤发生发展中的作用。1．pci K在肿瘤中的表达研究 尽管已有研究表明卯。在肺癌中表达增高，但它在其它肿瘤中的表达情况还不清楚。我们利用荧光实时定量PCR检测了门 对癌和癌旁正常组织中p＊。的表达情况。在130对组织标本中，大肠癌占59例，胃癌48例，肺癌23例。先从组织中提取RNA，逆转录成CDNA，作为定量PCR的模板。比较每个标本的Ct值，并以GAPDH为内对照，进行统计学分析。与以前的结果不同，我们发现p＊。在肺癌，大肠癌和胃癌组织中均表达降低，具有统计学意义0刃刀 1人 23例肺癌中，有 20例卯。在癌中表达降低；59例大肠癌中 50例比正常组织表达水平低；48例胃癌中44例p。表达降低。pci。表达与患者年龄、性别、肿瘤病理类型和分期没有明显关系。P。l。的差异表达的原因不清，促使我们对其转录调控机制开展研究。2．5’侧翼区的克隆2＊ 首先我们进行了 P＊。基因的转录起始点定位。采用 5’。DNA末端快速扩增法（RACE）和套式 PCR两种方法。5 nCE利用 Takara公司的试剂盒，从提取Hela细胞总RNA开始按说明操作。套式PCR是以人结肠组织。DNA文库来源的 lgtll DNA为模板，进行 2轮扩增。两种方法得到的片段进行经过测序，与己知的。DNA序列和基因组序列对比分析。我们获得了 2个特异性的克隆 kC 90和kC320。kC190的 5’端与已知 POIK CDNA的第二个外显子的起始点对应。kC320除了与第二个外显子匹配之外，有一段新序列（exonl’）在己知的cDNA不能匹配。经过与基因组DNA比较，exonl位于已知的前两个外显子之间，而且它与邻近序 2 浙江大学博土学位论文列的关系符合内含于和外显子剪接的 AG／GT规律，说明 exonl’可能是 ol新的外显子，其5’端代表新的转录起始点。尽管如此，由于软件分析发现己知的转录起始点上游正好有1个潜在的启动子结构，我们还是以这个转录起始点为刊进行5’侧翼区的克隆。2．2 根据 5’端的基因组序列，我们设计合成了引物，以基因组 DNA为模板，扩增转录起始点上游的序列。预期长度的PCR产物经过纯化，克隆到Teasy载体上，酶切和测序鉴定。生物信息学软件分析表明，可能的启动子位于5’侧翼区序列677～6之间。POI。的启动子没有 TM结构，但 GC?