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以蛇入药治疗多种疾病在我国已有相当悠久的历史。银环蛇(Bungarus multicinctus)俗称金钱白花蛇,隶属于脊索动物门、爬行纲、有鳞目、眼镜蛇科、环蛇属。中医学认为金钱白花蛇味甘、咸,性温、有毒,具有祛风、通络、定惊、止痒、止痉的功能。蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液,作为一类天然的动物毒素蛋白,其含有多种酶类蛋白、非酶蛋白和其他小分子物质,并具有广泛的生物学活性和药理作用,最明显的特征就是具有极强的毒性。银环蛇蛇毒含有多种活性成分,是复杂的混合物,主要以神经毒素为主。中医历来有“以毒攻毒”的治疗法则,研究表明蛇毒中含有纤溶、促凝、镇痛、抗癌等方面的药理功能成分,具有降压、镇痛、消炎和抗肿瘤作用。目前为止,蛇毒液中的某些活性成分经过修饰和改造已被制成成品药,用于临床上疾病的治疗。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展以及日益成熟,越来越多的科研人员将研究重点转移到动物药中多肽物质的研究与开发上来,动物药成为寻找与开发天然活性药物的源泉。因此,探究银环蛇蛇毒的成分以及其发挥药理作用的活性物质具有极其重要的理论和现实意义。本研究利用Illumia HiseqTM2500技术构建且分析银环蛇的转录组文库。使用Trinity拼接软件对所得到的序列进行De novo拼接,最终共获得63,947条高质量的 Unigene(>200bp),总长度为 64,485,567 bp,其中最长 Unigene 为 23,902 bp,最短为200 bp,平均长度为1008 bp,N50为1806 bp。通过Blastx搜索五大数据库进行基因功能注释,共有21,900条(34.25%)Unigene在NR数据库中存在着相似序列。在NR库注释中筛选出与毒素有关的Unigene,显示银环蛇蛇毒富含神经毒素。同时,分别有17,987条(28.13%)、13,963条(21.84%)、6981条(10.92%)、15,964 条(24.96%)Unigene 在 SWISSPROT、KOG、KEGG和GO数据库中注释成功。结果表明,构建的银环蛇转录组文库质量较高,筛选获得的毒素相关Unigene为银环蛇功能基因的分子克隆、蛇的药用价值研究奠定了基础。采用三步层析纯化法,即凝胶过滤层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析,从银环蛇粗毒中分离纯化得到一种新的L-氨基酸氧化酶,并命名为Bm-LAAO,每500 mg银环蛇蛇毒中纯化得到4.40 mg的LAAO,约占蛇毒总蛋白质含量的0.88%。纯化得到的Bm-LAAO的总活力为297.81 U,酶的比活力为67.70 U/mg,通过RP-HPLC技术和SDS-PAGE均证实其为均一蛋白。通过肽质量指纹图谱分析发现,本研究分离得到的银环蛇LAAO的蛋白序列与NCBI数据库中银环蛇LAAO的cDNA序列高度相符合。Bm-LAAO是一种糖基化的黄素蛋白酶,在还原条件下,其表观分子质量约为62.5 KDa。大部分的蛇毒LAAO在37℃左右活性最高,然而,Bm-LAAO的反应最适温度为45℃,最适pH分别为8.4。酶动力学研究表明,此酶对疏水性L-氨基酸具有较高的催化活性,且不能催化D-氨基酸的氧化脱氨反应,最好的底物基质是L-Met、L-Leu、L-Phe。研究发现去糖基化的Bm-LAAO的酶活力下降了 54.3%,说明糖基化对银环蛇的酶活性有较大的影响。储存温度同样对Bm-LAAO也很重要,相对而言,-80℃是最佳的储存温度。利用PCR技术,本研究从提取的银环蛇毒腺总RNA中克隆出了Bm-LAAO的cDNA序列,该序列编码一条由496个氨基酸残基组成的成熟肽。并采用蛋白质的同源建模技术,以哈里氏蝮蛇毒LAAO的晶体结构作为模板,预测Bm-LAAO的三维结构。本研究利用抑制肿瘤细胞增殖作用的体外实验对Bm-LAAO的抗肿瘤活性进行测定,采用MTT法测定其对肿瘤细胞和人正常细胞增殖能力的影响,采用显微镜及流式细胞仪观察和检测Bm-LAAO对肿瘤细胞的细胞凋亡作用的影响。在所检测的11种肿瘤细胞株中,Bm-LAAO对人胃癌细胞MGC-803具有最强的增殖抑制活性,其IC50为314 ng/ml;对三种人乳腺癌细胞BT474、MDA-MB-231、MCF-7的IC50分别为378、1213、1480 ng/ml,而对正常人乳腺细胞MCF-10A的IC50为13,556 ng/ml,分别是上述三种人乳腺癌细胞的35.86倍、11.18倍和9.16倍。研究表明,相对于正常细胞,Bm-LAAO对肿瘤细胞具有较强的选择性和细胞毒性。当过氧化氢酶及Bm-LAAO共同作用肿瘤细胞时,细胞活性恢复了 75%,表明在很大程度上,Bm-LAAO对细胞的增殖抑制活性可能是LAAO催化过程中产生的H2O2所致。流式细胞仪分析结果显示Bm-LAAO可以诱导MGC-803和MCF-7细胞凋亡,且呈现剂量依赖性的方式,而过氧化氢酶Catalase可以很大程度上减弱Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用,提示Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用也可能与H2O2的产生有关。综上所述,本研究构建并分析了银环蛇的转录组文库,且克隆得到了Bm-LAAO的基因序列;从银环蛇粗毒中分离纯化得到了 LAAO,并对其体外抗肿瘤作用和诱导细胞凋亡作用的机制进行了初步的研究,这为进一步深入地探讨其作用机制和可能的实际应用奠定了基础。