水生拉恩氏菌HX2细菌素合成相关基因分析和皱褶假单胞菌P94初步研究

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Rahnella aquatilis HX2产生细菌素,对多种植物病原细菌具有平板抑制效果,具有较广泛的抑菌谱;温室和大田实验显示HX2菌株对由A.vitis K308引起的葡萄根癌病有较好的防治效果。本研究在前人研究的基础上系统研究了HX2细菌素合成相关基因及细菌素在HX2防治葡萄根癌病生防机理中的作用。   通过Tn5插入突变获得两株不产生细菌素的突变体MH15和MH16,Southern杂交表明Tn5在MH15和MH16中都是单拷贝插入。Tn5插入引起HX2细菌素产生性状缺失,并对菌株的生长也发生了影响,两个突变体在生长曲线的对数生长期与野生菌株没有差异,但稳定期明显长于野生菌株,使得突变体菌落直径在生长40 h后约为野生菌株的两倍。   构建了HX2基因组文库。利用鸟枪法和反向PCR法分别通过突变体MH15和MH16中克隆到了Tn5插入的侧翼序列,通过侧翼序列设计引物对构建的基因组文库进行筛选,将筛选到的阳性粘粒通过三亲杂交验证功能表明筛选到的阳性粘粒都能互补突变体,使突变体产生细菌素的能力得到恢复。将获得的阳性粘粒进行亚克隆获得2400 bp的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)可以互补突变体MH16。从阳性粘粒中获得一个辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇(包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF六个PQQ合成基因(长5374 bp)和一个1038 bp的未知功能的阅读框ORF-X)可以互补突变体MH15。构建了gdh基因缺失载体,HX2的gdh基因缺失菌株HX2Δgdh细菌素产生的性状同时缺失。构建了gdh和Pqq基因互补载体,通过三亲杂交转入突变体后都能使突变体产生细菌素的性状得到恢复,并且突变体生长性状也恢复到了野生菌的水平。将PQQ以0.01μM加入到培养基中也可以使MH15产生细菌素和生长的性状恢复到野生菌HX2水平。这些结果表明gdh基因和Pqq基因簇与HX2细菌素合成有关。   温室检测突变体和互补菌株在向日葵和葡萄上对A.vitis引起的根癌病的防治效果,实验结果表明,不产生细菌素的菌株(MH15、MH16)在向日葵上对根癌病的防效为28.8~33.3%,在葡萄上对根癌病的防效为77.4~82.1%,产生细菌素的菌株(HX2、CH15、CH16和MH15+PQQ)在向日葵和葡萄上对根癌病的防效没有差异,为92.3~100%;大田防效检测结果表明,产素缺失突变体对葡萄根癌病的防效由野生菌株(HX2)的80.2%下降到了45.1%(MH15)和55.7%(MH16);产素缺失突变体在葡萄上对A.vitis K308引起的根癌病的防效要优于在向日葵上对其的防效。这些结果表明细菌素在HX2生防机理中占有重要作用,但并不是其唯一机理。   从北京地区土壤中分离出628株细菌,从中筛选出10株对番茄灰霉病菌有拮抗作用的细菌,其中P94的拮抗能力最强。生防菌株P94的抑菌谱实验结果表明P94对多种植物病原细菌和病原真菌有抑制作用。P94在向日葵、番茄和烟草上无致病性。通过Biolog鉴定系统,16S rDNA序列测定,生理生化特征,将生防菌株P94鉴定为皱褶假单胞Pseudomonas corrugata。用两对特异性引物将P94鉴定为P.corrugata基因群Ⅱ。生防菌株P94在番茄叶片上对灰霉病的防效达55.3%。与生防相关的HCN、IAA、磷酸脂酶、蛋白酶等性状在P94生防菌株上表现阳性,说明其生防机理与抑菌和促进植物生长有关。
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