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缺血性脑卒中,又称中风,是一种常见急性脑血管疾病,通常由大脑局部缺血而引起。脑卒中造成神经元的死亡及神经功能障碍,已成为全球第二大致死病因。缺血性脑卒中的病理机制复杂,目前尚缺乏有效治疗药物,因此亟需对其病理机制进行深入研究,并在此基础上寻找脑卒中的药物干预新靶标。神经元代谢旺盛,且其抗氧化能力弱、对氧化损伤敏感。脑卒中后,神经细胞内生成的大量活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）导致神经细胞氧化应激进而造成脑损伤。减少脑卒中的氧化损伤是公认的药物干预策略。然而,脑卒中病程长,缺血神经元在不同病理阶段发生氧化应激的机制复杂,如何有效的恢复卒中脑内的氧化/还原平衡尚不完全清楚。在缺血脑内,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）是一种重要的抗氧化物质。NADPH经谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还原蛋白系统代谢为还原性谷胱甘肽,进而参与神经元抗氧化。NADPH在神经元中主要由葡萄糖经磷酸戊糖途径代谢产生。TP-53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）催化2,6-二磷酸果糖生成6-磷酸果糖,从而将葡萄糖代谢从糖酵解转为磷酸戊糖途径,进而增加NADPH的水平。研究发现,过表达TIGAR减轻瞬时缺血所致神经元氧化应激,发挥保护作用,提示激活TIGAR介导的磷酸戊糖途径是一潜在的脑缺血药物干预策略。然而,大部分脑卒中病例经历较长时程的缺血。研究指出,在长时程缺血后,由于神经元胞内葡萄糖耗竭,且调节糖酵解的关键酶-6-磷酸果糖-2-激酶-3累积,造成神经元中的葡萄糖代谢重新转为糖酵解,磷酸戊糖途径关闭,进而导致NADPH水平显著降低。但是即便如此,在经历长时程缺血后的脑组织中TIGAR仍然维持较高表达水平,此时TIGAR是否仍能减轻氧化应激和缺血损伤尚不清楚。本课题利用大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）-再灌注（Reperfusion,Rep）模型和氧糖剥夺（Oxygen-glucose deprivation,OGD）-复灌（Rep）模型在体内、外模拟脑缺血-复灌过程,使用基因过表达、基因沉默、药物干预、Cre-Lox P特异性基因敲除等手段,结合免疫印迹、免疫组化、活细胞成像、实时荧光定量PCR等技术,探究在脑缺血时程延长后,TIGAR是否以及如何发挥抗氧化和神经保护作用。研究发现,在经历0.5 h,1 h或2 h MCAO的小鼠缺血脑组织中,虽然TIGAR表达随缺血时程延长而上调,但NADPH水平持续降低。在MCAO小鼠脑内过表达TIGAR,虽可上调短时程缺血（0.5 h及1 h）后NADPH水平,但无法提高2 h MCAO后小鼠脑内NADPH,提示葡萄糖的磷酸戊糖途径代谢降低。令人意外的是,在小鼠脑内高表达TIGAR仍能逆转2 h MCAO导致的脑组织氧化应激,并显著降低脑梗死体积、改善神经症状评分。类似的,在体外培养的原代皮层神经元和SH-SY5Y细胞中,虽然过表达TIGAR并未增加胞内NADPH水平,但仍显著降低ROS水平并减少细胞死亡。上述结果提示,延长脑缺血时程后,TIGAR减轻氧化应激发挥的神经保护作用不依赖于磷酸戊糖途径。进一步研究发现,在SH-SY5Y细胞中,沉默磷酸戊糖途径的限速酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶抑制磷酸戊糖途径,未取消TIGAR的抗氧化作用和神经保护作用;过表达缺失磷酸戊糖途径酶活力的突变体TIGAR（H11A,E102A,H198A）,同样具有抗氧化和神经保护作用。以上结果表明,长时程脑缺血后,TIGAR经非磷酸戊糖途径依赖的机制发挥抗氧化作用并减轻脑损伤。研究指出,TIGAR在缺血神经元中可调节细胞自噬,通过清除产生ROS的细胞器,如线粒体及过氧化物酶体等,进而发挥抗氧化作用。实验发现,在体外培养的神经细胞OGD模型中,沉默TIGAR显著降低LC3B-II水平、增加p62水平,表明可抑制细胞自噬。反之,过表达TIGAR或其突变体（H11A,E102A,H198A）均可显著激活细胞自噬。不仅如此,给予自噬抑制剂渥曼青霉素/氯喹,或敲除神经元中的Atg7,均可取消TIGAR的抗氧化作用和神经保护作用。上述结果表明TIGAR经非磷酸戊糖途径调控缺血神经元自噬,并发挥抗氧化作用。但是,在神经细胞中过表达TIGAR,未显著激活线粒体自噬及过氧化物酶体自噬,提示TIGAR激活的自噬并非通过清除线粒体及过氧化物酶体而发挥抗氧化作用。为阐明TIGAR经非磷酸戊糖途径发挥抗氧化作用的机制,我们进一步对调控氧化应激的关键转录因子核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）进行了研究。Kelch样环氧氯烷相关蛋白1（Kelch-like ECHAssociating Protein 1,KEAP1）可通过在胞内与Nrf2形成复合体抑制其入核激活抗氧化蛋白转录。结果发现,过表达TIGAR下调KEAP1水平,促进Nrf2入核,并上调其下游抗氧化的靶基因血红素氧合酶-1和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基的转录水平,自噬抑制剂渥曼青霉素可取消上述作用。该结果表明,TIGAR通过激活自噬降解KEAP1,进而激活Nrf2介导的抗氧化物酶表达。进一步,在神经细胞中给予Nrf2抑制剂ML385或沉默Nrf2基因均可取消TIGAR的抗氧化作用和神经保护作用。并且,利用小鼠MCAO模型,在其大脑皮层和纹状体内沉默Nrf2,可取消过表达TIGAR带来的抗脑缺血神经保护作用。上述结果表明,TIGAR通过非磷酸戊糖途径激活自噬,进而促进了Nrf2信号通路激活,发挥抗氧化作用。综上所述,本研究首次揭示在长时程脑缺血后,TIGAR经非磷酸戊糖途径依赖的抗氧化机制减轻了缺血性脑损伤。TIGAR的上述作用依赖于诱导自噬并激活Nrf2相关的抗氧化途径。本研究揭示了TIGAR的一种抗氧化新机制,补充了TIGAR的抗氧化作用理论,并部分解释了神经元在葡萄糖供应不足、磷酸戊糖途径关闭的条件下如何维持抗氧化能力,为相关的抗缺血性脑卒中药物研发提供了药理学实验依据。