茶树炭疽病的病原鉴定及其遗传多样性分析

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炭疽菌Colletotrichum Corda种类繁多,不同种类炭疽菌生物学特性存在差异。炭疽菌寄主范围极广,其侵染茶树引起茶树炭疽病,该病在全国各茶区普遍发生,主要危害叶部,一般从幼龄叶片背部毛孔侵入,经8~15d潜伏期后开始形成病斑,遇到温暖湿润时易造成该病大面积爆发流行,造成严重的经济损失。茶树炭疽病的发生造成茶叶产量和品质下降,影响茶叶的经济效益,为此,有必要对引起茶树炭疽病的病原菌种类进行调查研究,明确其种类和分布情况,为有效防治该病提供理论依据。本研究从福建省福州、周宁、武夷山、安溪和永春等5个茶区的茶树上采集炭疽病叶,采用单孢分离法分离病原菌,共分离到25株炭疽菌,其中福州茶区分离到9株、周宁6株、安溪4株、武夷山和永春各3株,用离体法进行菌株接种茶叶测定各菌株致病性,经鉴定确认为病原菌后,将各菌株保存在4~8℃冰箱内备用。采用形态学结合多基因(rDNA-ITS、LSU、β-Tub2和GS)系统发育分析,并参考单个基因序列分析对分离到的炭疽菌进行种类鉴定。试验结果表明,能侵染茶树的25株炭疽菌可分为6个种,即C. karstii、C.fioriniae、C. fructicola、C. siamense、C. sp.1和C. sp.2。其中C. karstii、C. fioriniae、C. fructicola、C. siamense等4个种在茶树上为新记录种,还有2株菌株种名未定。从上述茶区标本上分离的菌株来看,不同种类菌株出现频率存在差异,以C. fructicola最多,共得9株,5个茶区都获得该种菌株,其在铁观音、黄观音、福建水仙、黄旦和肉桂等5个茶树品种上均有分布,而且在福州、周宁、永春和安溪4个茶区铁观音茶树上均分离C. fructicola菌,可见该种菌寄主范围和地理分布较广。在对寄主为茶树炭疽菌各基因序列进行分析比对时发现,来源地不同的4株C. fioriniae菌的Tub2基因序列存在差异,可能存在生理小种。其它5个种的菌株种内同样存在遗传多样性。将参试的25株炭疽菌与从其他植物上分离获得21株炭疽菌的rDNA-ITS序列相同基因序列进行多序列比对,结果发现,茶树上分离的所有炭疽菌的rDNA-ITS序列均在第5基因位点上多插入1个碱基A,茶树炭疽菌ITS序列这一点变异,可能是该病原菌与寄主茶树互作的结果。对茶树炭疽菌的ITS序列进行分析还发现,菌株ZRG存在多处与其他菌株都不同的变异位点,这反映出它与其他菌株存在一定程度差异。比较其余3条基因序列发现GS和Tub2基因中存在较多基因的变异,但没有发现与其他菌株存在明显差异的基因序列;LSU基因中的变异数相对较少。在对茶树炭疽菌形态特征进行分析时发现,炭疽菌的菌落、分生孢子和附着孢等形态特征只是相对稳定。培养时间可影响菌落形态,如随培养时间的延长,部分菌株气生菌丝颜色加深,菌落背面沉积物增加,表面形成油滴或拟菌核等。培养环境也会影响菌株的生长,如在培养温度32℃时,所有菌株生长受到明显抑制,部分菌株不能生长,研究表明,C. karstii最耐高温,C. fioriniae则不耐高温;在一定的范围内(pH5.0~10.0),pH值对菌落形态影响较小,所有菌株均适宜生长在中性偏酸环境。此外不同培养基也会影响菌落形态与产孢能力,以PSA培养基最适宜茶树炭疽菌的生长。采用离体法对所得菌株进行致病性测定,采用同种茶树叶片作为接种体,结果发现,供试菌株致病力可分为特强、强、较强、弱4种类型,其中菌株ZRG的致病力最强,其次是YFS菌株,致病力的强弱是否与碱基的变异有关还需做更深入的探讨;总之,C.sp.1菌的致病力强于其他几个菌株。本研究采用在国外已很常用的多基因系统发育学分析法并结合形态学特征,系统地对侵染茶树的炭疽菌进行种类鉴定,有4个种在茶树上为新记录种,加深了人们对该菌的认识,并在防治茶树炭疽病及茶树育种方面实践具有重要的指导意义。
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