葡萄糖-6-磷酸异构酶的分离纯化及其性质研究

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催化蛋白质水解反应的蛋白酶活性受几种机制的控制,包括天然蛋白酶抑制剂的抑制作用。大多数蛋白酶抑制剂通过对蛋白酶活性的可逆抑制作用调控细胞生理过程。而在鱼糜制品的生产中,由于一些内源性蛋白酶的降解作用造成了鱼糜凝胶劣化,影响了鱼糜制品的商业价值,虽然一些蛋白酶抑制剂的使用可防止鱼糜凝胶劣化现象,但是添加这些含蛋白酶抑制剂物质会给最终产品带来不良的风味和色泽,因此需要研制其它替代抑制剂来改善最终产品的品质。   而最近从海水白姑鱼中得到的一种内源性抑制剂能够有效并且专一性的抑制肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-boundserineproteinase,MBSP)降解肌原纤维,而研究发现肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶被认为是鱼糜生产中造成凝胶劣化现象的主要因素。而在接下来的研究中又发现这种新型的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂可能就是葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucosephosphateisomerase,GPI)。显示GPI可以作为MBSP的内源性抑制剂,添加到鱼糜制品中来抑制鱼糜凝胶的劣化。   因此本论文以葡萄糖-6-磷酸异构酶作为研究目标,以淡水乌鳢和哺乳动物猪为对象,通过一系列纯化步骤来实现了葡萄糖-6-磷酸异构酶的分离纯化,对其酶学性质作了较为详细的分析。并以鲫鱼MBSP为对象,研究了淡水乌鳢GPI和哺乳动物猪GPI能否抑制鲫鱼MBSP活性,及其GPI对MBSP的抑制机理,这可以为今后GPI作为MBSP抑制剂的应用提供一定的理论依据,并可提高鱼糜制品的附加值,为推动我国鱼糜加工业的发展提供一条新思路。   猪肌肉粗提后,经DEAE-Sepharose,45℃加热,SP-Sepharose,以及Hvdroxyapatite层析柱后可分离纯化得到葡萄糖-6-磷酸异构酶,纯化倍数为105.6,比活力为159.4U/mg。通过SDS-PAGE和凝胶过滤可确定纯化的猪GPI为单体,分子量约为55kDa。Westernblot结果显示,猪GPI能够和抗白姑鱼GPI抗体发生免疫交叉反应。酶学性质研究显示猪GPI催化果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F-6-P)异构为葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate,G-6-P)的最适温度及pH值分别为50℃和8.5。在pH8.5,25℃条件下测得Km值为0.39mmol·L-1,最大反应速率Vmax为0.61mmol·L-1·min。   乌鳢肌肉粗提后,经DEAE-Sepharose,SP-Sepharose,Hydroxyapatite以及HighQ层析柱后可分离纯化得到GPI,纯化倍数为74.2倍,比活力为0.89U·mg-1。通过SDS-PAGE和凝胶过滤可确定纯化的乌鳢GPI同样为单体,分子量约为55kDa。Westernblot结果显示,乌鳢GPI能够和抗白姑鱼GPI抗体发生免疫交叉反应。酶学性质研究显示乌鳢GPI催化果糖-6-磷酸异构为葡萄糖-6-磷酸的最适温度及pH值分别为50℃和9.0。在pH8.5,25℃条件下测得Km为0.58mmol·L-1,最大反应速率Vmax为0.36mmol·L-1·min。   而对GPI与MBSP相互关系的研究中,发现乌鳢和猪GPI对鲫鱼MBSP均有很强的抑制作用,并且随着GPI量的增加,GPI对MBSP的抑制作用增强。并且证明了两者的GPI对MBSP抑制作用都是可逆竞争性抑制作用,GPI有可能是通过与MBSP非共价键结合从而引起MBSP空间结构的改变从而影响其活力的。
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