论文部分内容阅读
实验目的：卵巢癌是一种对女性健康起到严重威胁作用的恶性肿瘤，是女性生殖系统最常见的三大癌症之一。研究发现在多种癌症中肿瘤高甲基化基因1(hype-rmehylated in cancer1，HIC1)经常因发生高甲基化而导致表达沉默，但是在卵巢癌中DNA甲基化转移酶（DNMTs）影响HIC1的表达及其调控机制尚无深入研究。本实验探讨DNMTs影响HIC1的表达及其调控HIC1/SIRT1通路在卵巢癌中的分子机制。实验方法：组织实验：运用免疫组织化学方法检测26例卵巢癌临床组织样本及10例正常卵巢组织中DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）、DNA甲基化转移酶3a（DNA methyltransferase3a，DNMT3a）、HIC1(Hyperme-thylated in cancer-l)及沉默调节蛋白1（Sirtuin type1，SIRT1）的表达，并统计分析DNMT1与HIC1蛋白表达之间的相关性及HIC1与SIRT1蛋白表达之间的相关性。进一步运用Western Blot方法检测卵巢癌组织及正常卵巢中HIC1及SIRT1的表达。细胞实验：培养上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3，采用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidin，5-Aza）作为工具药进行干预，分为对照组和给予5-Aza组。采用MTT法检测不同浓度药物处理不同时间对细胞增殖的影响，绘制细胞生长曲线；在倒置显微镜下观察给药前后细胞的形态学变化；采用流式细胞术观察药物对SKOV-3的细胞周期阻滞作用以及对细胞凋亡的影响。采用Western Blot方法检测给药前后细胞中HIC1、SIRT1蛋白表达的变化。实验结果：1.免疫组织化学结果显示，卵巢癌组织中DNMTs表达增加，而HIC1蛋白表达下调，与正常卵巢组织相比较，具有显著性差异（P<0.05）；且DNMTs与HIC1蛋白表达呈负相关关系（r2=0.82，P<0.01）。2.免疫组织化学和Western Blot实验观察发现，在卵巢癌中HIC1蛋白表达下调，而SIRT1蛋白表达升高，二者蛋白表达呈现负相关关系（r2=0.60P<0.01），与正常卵巢组织中的表达相比较具有显著性差异（P<0.05）。3.MTT结果显示，5-氮杂胞苷可以在不同程度上抑制SKOV-3细胞的生长，并且表现为时间和浓度的依赖性。在浓度低于1μM时5-氮杂胞苷对SKOV-3细胞无明显的抑制作用，其对肿瘤增殖的抑制功能还没有表现出来，而当5-氮杂胞苷的浓度高于5μM时，虽然对肿瘤细胞有较强的抑制作用，但也存在明显的细胞毒性。4.光镜下观察细胞形态发现，SKOV-3细胞经5-氮杂胞苷处理72h后，1μM药物处理组细胞小部分由梭形变圆，细胞核大，细胞膜完整，细胞间隙明显；2.5μM药物处理组细胞大部分形态趋于圆形，有发泡现象，细胞质中颗粒较多，贴壁能力下降；5μM药物处理组细胞大小趋于均匀，可见细胞碎片，部分细胞出现坏死，而未用药物处理的细胞贴壁牢，呈梭形，细胞增值速度明显快于加药组。5.流式细胞术检测细胞周期结果显示，5-氮杂胞苷处理SKOV-3细胞72h后，观察到G1期细胞的比例逐渐增多，细胞在G1期受到阻滞。并且随着5-氮杂胞苷浓度的增加，周期阻滞的趋势更加明显。5-氮杂胞苷不同浓度处理组与对照组相比较均具有统计学意义（P<0.05），5μM处理组与1μM处理组相比较具有显著性差异（P<0.05）。6.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，5-氮杂胞苷处理SKOV-3细胞72h后，随着5-氮杂胞苷浓度的增加，细胞的凋亡百分率逐渐增多，1μM、2.5μM、5μM处理SKOV-3细胞后凋亡细胞比例较对照组上升，且5μM处理组与1μM、2.5μM处理组组间比较具有显著性差异（P<0.05）。7.Western Blot检测结果发现，未处理的SKOV-3细胞中HIC1蛋白表达较弱，但是经过5-氮杂胞苷处理后的细胞HIC1表达增强。且随着5-氮杂胞苷浓度增大，HIC1表达增强，与对照组比较有显著性差异（P<0.01）。此外，5-氮杂胞苷处理细胞后可剂量依赖性地下调SIRTl的蛋白表达,与对照组比较有显著性差异（P<0.01）。实验结论：1.卵巢癌组织中DNMTs蛋白表达上调， HIC1蛋白表达下调；且DNMTs与HIC1蛋白表达呈负相关。说明DNMTs在影响HIC1的蛋白表达中起到重要作用。2.卵巢癌组织中SIRT1蛋白表达上调，且HIC1与SIRT1蛋白表达呈负相关。为在体外研究卵巢癌中HIC1/SIRT1信号通路提供了依据。3.通过应用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷抑制DNMTs的活性，可以上调卵巢癌细胞SKOV-3中HIC1蛋白的表达，下调SIRT1蛋白的表达，减慢细胞增殖速度，使细胞分裂停留在G1期，并且诱导细胞的凋亡。说明抑制DNMTs的活性，可以恢复HIC1的表达，可能通过调控HIC1/SIRT1通路发挥抑制卵巢癌生长的作用。