论文部分内容阅读
在抗肿瘤等方面，IL-18具有潜在的应用价值。之前关于重组人IL-18表达的研究主要是原核表达系统，不仅表达量低，而且活性低，分离纯化也较困难。为此，本文选用毕赤酵母菌GS115为宿主菌，成功构建了pPIC9K-rhIL-18表达载体，从重组毕赤酵母菌中得到能正确表达的工程菌Pichia pastoris GS115/hIL-18，然后进一步探讨其3L罐规模的发酵条件、产物纯化工艺以及体外的生物学作用。本文首先对重组表达载体pPIC9K-rhIL-18进行鉴定，并将其经电转化整合到毕赤酵母受体菌GS115的基因组中，再通过基因组PCR鉴定和筛选，MD板筛选单克隆，BMGY培养基诱导培养，SDS-PAGE和Western Blot蛋白鉴定等检测，最终得到能正确表达的重组菌株。本文发现不同的起始诱导菌体密度、温度、pH、溶解氧体积分数(DO)和甲醇诱导浓度等培养条件均影响3L罐规模rhIL-18的表达水平。经研究得到最佳表达条件：一级种子接入1.5LBSM培养基，起始诱导菌体密度为600，发酵过程中DO保持在20%左右，最佳pH为6.0，诱导温度23℃，甲醇诱导浓度为0.25%，整个发酵过程通过发酵罐控制软件系统进行在线控制和数据采集。本文初步摸索了rhIL-18分离纯化的工艺条件，研究结果显示，采用低温离心除去菌体，0.22μm膜过滤，30kD和10kD膜超滤，低温乙醇结合等电点沉淀，疏水层析的分离纯化方法，可以得到纯度在90%左右，收率42%的rhIL-18。本文通过MTT法和Hoechst33258染色检测了rhIL-18对人肝癌细胞株BEL-7402、人肝癌细胞株QGY-7703、人肝癌细胞株QSG-7701、人宫颈癌细胞株HeLa和人乳腺癌细胞株MCF-7的体外生物学作用，研究发现rhIL-18均能抑制这五种癌细胞的活性，并且其抑制程度与rhIL-18的浓度成正比；此外，rhIL-18还能促进上述五种细胞不同程度的凋亡。从而为进一步研究rhIL-18的生物学作用机理奠定了基础。