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苏云金素(Thuringiensin, Thu)是由一些苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的一种具有杀虫活性的小分子腺苷类化合物。本研究小组前期在Thu高产菌株CT-43中克隆到了Thu的合成基因簇,并推导和验证了其合成途径。Ⅳ型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中,也发现存在于少数革兰氏阳性细菌、无细胞壁细菌和古菌中。该分泌系统能够分泌如单聚体蛋白质、蛋白质-DNA和多亚基毒素等物质,但是目前为止还未有关于Ⅳ型分泌系统分泌小分子物质的报道。序列分析发现在CT-43中Thu合成基因簇附近含有virB4、virBll及virD4等类Ⅳ型分泌系统(Type IV secretion systems, T4SSs)相关基因,推测其可能与Thu的分泌相关。本研究拟通过基因敲除的方法,验证类Ⅳ型分泌系统相关基因(virBll和virD4)对Thu合成和分泌的影响。利用插入缺失突变的方法,构建同源双交换载体,首先敲除了CT-43中的virD4基因,得到的突变株BMB1122。HPLC检测BMB1122和CT-43胞外发酵上清液和胞内代谢物,结果显示突变株BMB1122发酵上清液和细胞内都未检测到Thu特征吸收峰,说明virD4基因中断影响了Thu的合成。进一步通过LCMS-IT-TOF飞行质谱检测突变株BMB1122的胞内代谢物,发现其细胞内含有与预测的Thu合成途径中所有中间产物相符的质荷比(m／z),只是没有检测到与Thu相符的质荷比。这些结果说明virD4基因的中断使Thu的合成停留在了最后加磷酸的那一步。此外,推导的Thu合成途径中最后一步是在跨膜的过程中添加一个分子的磷酸。因此,有可能是virD4基因的敲除破坏了类Ⅳ型分泌系统,使Thu合成过程的最后一个中间产物不能跨膜分泌。本研究同时也开展了virBll基因敲除和功能验证的工作,目前已经成功构建了用于同源双交换的基因敲除载体,virBll基因中断对Thu合成与分泌功能验证的后续工作还在进行中。本研究证明了virD4基因与Thu的合成相关,virD4基因的敲除使Thu的合成停留在了跨膜分泌的前一步。本研究的发现加深了我们对Thu合成与分泌过程的认识。本研究同时也证明了苏云金芽胞杆菌的类Ⅳ型分泌系统能分泌类似Thu的小分子物质,为革兰氏阳性细菌中类Ⅳ型系分泌系统的研究提供了新的信息。