研究背景骨肉瘤,是骨肿瘤中最为常见的一种恶性肿瘤。主要发病于10-25岁的青少年患者,男性多于女性。其好发年龄为青春期,此时期体内性激素水平最为活跃,人体生长最为旺盛,这提示该疾病可能与人体内雌激素水平及相应受体表达异常有密切关系[l]。传统的治疗方法为单纯的截肢手术,治疗效果极差,致残率高,5年生存率低。骨肉瘤极早期即发生血行转移,肺部转移是骨肉瘤患者最主要的致死原因。目前控制骨肉瘤肺部转移最关键的临床治疗手段是化疗。然而,化疗过程中经常出现的严重毒副反应,严重影响化疗的进行,因此使用传统的化疗等治疗方案也很难达到令人满意的临床效果。雌激素由卵泡和胎盘产生,肾上腺及雄性的睾丸也可以产生少量雌激素,促进女性生殖系统发育,是人体内一种重要的性激素。雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)是一类由配体激活的转录因子,是核受体超家族成员之一。雌激素通过与靶器官的雌激素受体结合而发挥其功能。大量的临床及实验研究表明,雌激素受体在骨肉瘤病例中存在表达,包括ERa及ERβ受体,提示骨肉瘤可能是激素依赖性肿瘤。内分泌治疗是近年兴起的治疗肿瘤的综合手段之一。内分泌治疗通过抑制相应的激素合成、降低激素释放水平、降低激素及其受体活性、阻断激素与其相应受体的结合等多种途径,达到抑制激素依赖性肿瘤的发生及肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,减弱肿瘤细胞侵袭力及转移,从而达到治疗肿瘤的目的。因激素本身是体内存在的正常成分,因此内分泌治疗的最大优点在于毒副作用小、效应持久且作用于全身,对有肿瘤远处转移的患者同样有很好的疗效。本研究通过对植物雌激素芒柄花黄素对骨肉瘤这一激素依赖性肿瘤的作用效果的观察,初步探讨雌激素在骨肉瘤中可能扮演的作用,为骨肉瘤的的内分泌治疗及预后判断提供一定的参考依据。目的1.通过体外实验,研究植物雌激素芒柄花黄素对骨肉瘤U20S细胞增殖凋亡的作用；2.通过体内实验,研究芒柄花黄素对裸鼠骨肉瘤移植瘤的抑制作用及药物对裸鼠的毒副作用；3.明确可能参与芒柄花黄素对骨肉瘤抗肿瘤效应的作用机制。方法1.选用人骨肉瘤U20S细胞株,用不同浓度的芒柄花黄素(0,20,40及80μM)干预细胞,采用MTT法、流式细胞术等方法,检测芒柄花黄素对骨肉瘤U20S细胞抑制增殖、诱导细胞凋亡方面的影响；在流式细胞仪(FACSCalibur)上分析荧光强度,定量检测细胞周期中G0-G1、S、和G2-M期所占百分比。Hoechst 33258染色法观察细胞形态。采用蛋白免疫印迹、Real-time PCR等方法,检测芒柄花黄素调控骨肉瘤U20S细胞Bcl-2、Bax及miR-375的表达情况。2.建立裸鼠荷人骨肉瘤U20S细胞移植瘤动物模型,用不同浓度的芒柄花黄素(0,20,40及80μM)干预肿瘤生长,观察芒柄花黄素对肿瘤体积、重量的抑制率,药物的毒副作用；采用肿瘤组织切片HE染色及免疫组化法,观察肿瘤组织中Bcl-2、Bax的表达情况；采用蛋白免疫印迹、Real-time PCR检测芒柄花黄素调控肿瘤组织中Bcl-2、Bax及miR-375的表达情况。结果1.MTT结果显示,芒柄花黄素对骨肉瘤U20S细胞增殖有明显抑制作用,并呈剂量和时间依赖性(P<0.05)。经80μM的芒柄花黄素处理后72小时后,其生长抑制率可达到71%。在细胞周期中,G0/G1期的分布比例较高,在G0/G1期的分布比例随芒柄花黄素浓度的提高而逐渐增加。2.流式细胞术结果显示,芒柄花黄素有着明显诱导骨肉瘤U20S细胞凋亡的作用。经40,80μM的芒柄花黄素处理后,其细胞凋亡率分别为23%,34%(P<0.05)。效应呈浓度和时间依赖性。3. Hoechst 33258染色显示：随着芒柄花黄素药物浓度升高,其对U20S诱导凋亡的效果越明显,细胞凋亡率越高,且呈浓度依赖性。4. Western blot及Real-time PCR结果显示：芒柄花黄素可上调骨肉瘤U20S细胞Bax的表达及下调Bcl-2及miR-375的表达,且呈浓度依赖效应。5.芒柄花黄素对裸鼠移植瘤的有明显的抑瘤作用,80μM的芒柄花黄素处理对肿瘤体积抑制率为41.12%,重量抑制率为39.53%。药物对裸鼠的一般情况及肝肾功能未见明显毒副作用。6.肿瘤组织切片及免疫组化法结果,Bcl-2阳性表达随芒柄花黄素干预浓度增加而减弱；而Bax阳性则随芒柄花黄素干预浓度增加而增强。7. Western blot及Real-time PCR法检测结果显示,肿瘤组织中,随着芒柄花黄素浓度由逐渐提高,Bcl-2及miR-375表达量进行性减低,Bax的表达进行性增高。结论1.芒柄花黄素对骨肉瘤U20S细胞增殖有明显抑制作用,并呈浓度和时间依赖性,主要可能是通过促进G0/G1期细胞阻滞实现的。2.芒柄花黄素对骨肉瘤U20S细胞有诱导细胞凋亡的作用,并呈浓度和时间依赖性。随着芒柄花黄素药物浓度升高,U20S细胞凋亡率越明显。3.芒柄花黄素对裸鼠移植瘤的体积、重量均有明显的抑制作用,且呈浓度依赖效应。4.芒柄花黄素对裸鼠的生长及脏器未见明显毒副作用。5.芒柄花黄素体内体外抗骨肉瘤的机制可能是通过上调Bax的表达及下调Bcl-2、miR-375的表达来实现的。