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研究目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性风湿免疫疾病,主要表现为反复的滑膜炎,导致多关节肿痛、变形、活动受限,往往演变成残疾,是致残率最高的关节疾病,严重影响了生活质量,是一种终身性疾病。目前RA的具体病因尚不明确。本课题根据湿性重浊粘滞,久湿形成毒,湿毒郁久化热致瘀,阻滞经脉筋肉,结合西方病因学说“体液论”,提出“湿毒入络”可能导致RA的病因学理论。湿毒入络,体液的流动或迁移可能刺激水通道蛋白(AQPs)的异常表达;RA的活动期炎性渗出,滑膜充血水肿,也可能伴随水的异常代谢。已有报道,AQPs在RA的发展过程中发挥着一定的作用,可介导其病理变化过程中的细胞迁移。另外,临床上尚无根治RA的办法,大多只停留在对症治疗,缺乏对因治疗。本课题针对RA的病因病机“湿毒入络”,拟方三黄一龙汤(SYD)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗RA湿热痹阻证,从临床和动物实验两方面对RA发病机制和三黄一龙汤或联合MTX的作用机理进行了研究。研究方法本课题的第一部分以RA湿热痹阻证患者的外周血和滑膜液作为研究对象,从细胞因子、AQPs及JAK-STAT通路的信号因子等的表达及调控方面进行了初步研究,主要采用ELISA法检测相关指标。第二部分复制出RA湿毒入络动物模型,以大鼠的外周血、骨关节、肺、脾、肾脏等作为研究对象,从炎性因子、AQPs、Na~+,K~+-ATP酶、JAK-STAT通路的信号因子及关节病理组织学的变化及调控进行了深入研究,采用了ELISA法、RT-PCR法及病理组织学等检测方法。研究结果一、RA湿热痹阻证患者炎性因子、AQPs及JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制1、RA湿热痹阻证患者炎性因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响(1)RA湿热痹阻证患者活动期关节肿胀指数、压痛指数以及ESR、CRP、DAS28明显升高;采用SYD联合MTX治疗,其关节肿胀指数、压痛指数及ESR、CRP、DAS28能较快较好地改善。(2)RA湿热痹阻证患者外周血TNF-α、IFN-γ较健康对照组显著升高,滑膜液TNF-α、IFN-γ较外周血明显升高。(3)采用SYD联合MTX治疗后TNF-α、IFN-γ显著下降。2、RA湿热痹阻证患者AQPs的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响(1)RA湿热痹阻证患者外周血和滑膜液中AQP1、AQP2和AQP3的表达水平较健康者明显降低。(2)外周血中AQP1、AQP2、AQP3表达略高于滑膜液,以AQP1表达最多,AQP3次之,AQP2表达最少。(3)SYD联合MTX可以使RA湿热痹阻证患者低表达的AQP1、AQP2和AQP3上调。3、RA湿热痹阻证患者JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响(1)RA湿热痹阻证患者STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1、SOCS-3的表达水平较健康者都降低,其中STAT1表达高于STAT3,PIAS1表达高于PIAS3,SOCS-1与SOCS-3表达相当。(2)RA外周血中STAT1、PIAS1、PIAS3、SOCS-1的表达高于滑膜液,而外周血中STAT3、SOCS-3与滑膜液中基本相当。(3)经SYD联合MTX治疗,RA湿热痹阻证患者外周血STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1都下调,SOCS-3无明显变化。二、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子、AQPs、Na~+,K~+-ATPase、JAK-STAT通路信号因子及关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制1、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响(1)RA湿毒入络模型大鼠显示血小板数、中性粒细胞比率和单核细胞比率较正常组明显升高,淋巴细胞比率较正常组明显降低。SYD及SYD联合MTX能较好地降低中性粒细胞和单核细胞比率,上调淋巴细胞比率。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中IL-6和TNF-α表达水平较正常组都明显降低;骨关节中IL-6和TNF-α表达较正常组都明显升高。SYD及SYD联合MTX都能使外周血低下的IL-6和TNF-α上调,使骨关节中升高的IL-6和TNF-α下调。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血中VEGF表达较正常组无差异,而其骨关节中VEGF表达较正常组明显增多。SYD及SYD联合MTX均能使骨关节中增多的VEGF减少。(4)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组无差异;而其炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组明显减少。SYD联合MTX可促进炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的表达。2、RA湿毒入络模型大鼠AQPs、Na~+,K~+-ATP酶的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响(1)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3表达较正常组均明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中以AQP2表达最高,其次是AQP3;骨关节中以AQP3表达水平最高,其次是AQP2。(3)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中AQP1mRNA的含量较正常组明显减少,其肾组织AQP1mRNA的含量较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na~+,K~+-ATP酶的活性较正常组明显减退。(5)SYD及SYD联合MTX都能较好地促进RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3的表达,SYD联合MTX还能显著地增强肺组织AQP1mRNA的表达。(6)SYD及SYD联合MTX能显著地提高RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na~+,K~+-ATP酶的活性。3、RA湿毒入络模型大鼠JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响(1)RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3表达较正常组明显降低;骨关节中JAK1、JAK3表达较正常组明显升高;JAK2表达较正常组明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中JAK3mRNA的含量较正常组无差异;肾组织中JAK3mRNA的含量较正常组明显增多。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中STAT1表达较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠外周血中STAT3表达较正常组明显降低;骨关节中STAT3表达较正常组无差异。(5)SYD及SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3及骨关节中JAK2的表达上调。(6)SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠骨关节中升高的JAK1、JAK3表达下调。(7)SYD及SYD联合MTX能上调外周血STAT3的表达。(8)SYD及SYD联合MTX能抑制肾组织中JAK3mRNA的表达。4、RA湿毒入络模型大鼠关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响(1)RA湿毒入络证模型大鼠关节组织病理学表现为巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。(2)SYD联合MTX能抑制RA湿毒入络模型大鼠关节纤维组织的增生和淋巴细胞的浸润。结论:本研究证实了湿毒入络是RA的基本病机。湿毒入络诱导RA发病与AQPs、Na~+,K~+-ATP酶、JAK等密切相关,表现出外周血、骨关节及肺脾肾脏等组织器官中AQP的亚型AQP1、AQP2、AQP3及AQP1mRNA表达减少,Na~+,K~+-ATP酶活性减退,骨关节促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)产生增多,软组织TGF-β1mRNA减少,信号因子JAK1、JAK3及JAK3mRNA异常表达,关节巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。印证了肺主通调水道、脾主运化功能参与了RA湿毒入络的发生发展过程。证明了三黄一龙汤及三黄一龙汤联合MTX能较好地降低RA的关节肿胀、压痛指数,降低ESR、CRP、DAS28等炎症指标,抑制外周血和骨关节炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和血管内皮生长因子(VEGF)产生,促进TGF-β1mRNA分泌,增强外周血和骨关节AQP1、AQP2、AQP3及肺脏AQP1mRNA的表达,提高脾脏Na~+,K~+-ATP酶的活性,调控信号因子JAK1、JAK2、JAK3及STAT3等的表达。可作用于多组织器官,多靶点进行调节,增强组织细胞的代谢,缓解关节滑膜炎症,抑制滑膜组织血管新生。这为临床推广应用提供了理论依据。