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研究背景骨髓移植是治疗恶性血液病、免疫功能低下、恶性实体瘤、骨髓抑制和缺血性疾病等的重要手段。骨髓移植前通常需要对患者进行大剂量放疗或化疗,由此所致的骨髓严重抑制使得造血干/祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cells,HSCs/HPCs）植入率低下和造血重建困难,最终导致移植失败,这是骨髓移植亟待解决的科学问题。当归是中医临床的“补血、活血”要药,有“补血益气”之功效,已有数千年的临床应用历史。当归多糖（Angelica Sinensis Polysaccharide,ASP）是当归的主要药物活性成分。文献报道,ASP对机体的造血系统和免疫系统有明确促进作用,抗肿瘤和抗辐射损伤也有显著功效。课题组前期工作证明,ASP既能促进造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）增殖与分化,也能改善造血诱导微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）功能,但机制尚不清楚。现代造血理论认为,骨髓HIM对HSCs的自我更新和多向分化起着极为重要调控作用。研究证明,骨髓HIM的核心成分是骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）,BMSCs不仅为造血细胞增殖与分化提供生物支架,而且还可以通过分泌造血生长因子（hematopoietic growth factor,HGF）来调控血细胞的发生。基于既往研究结果,我们推测移植供体小鼠骨髓细胞后,给受体小鼠注射ASP能促进供体小鼠骨髓HSCs对受体小鼠的造血重建功能。本课题通过构建小鼠骨髓移植模型,给受体小鼠移植供体小鼠骨髓单个核细胞,并注射ASP干预,阐释ASP对受体小鼠重建造血功能的影响和初步机制,旨在为ASP用于骨髓移植重建造血功能提供理论依据和实验室资料。技术方法1.小鼠骨髓移植模型建立与给药:颈椎脱臼处死雄性供体小鼠,取股骨,制备骨髓单个核细胞悬液,计数待用。将雌性受体小鼠放入特制的有机玻璃箱中,给予小鼠全身一次性致死剂量X射线照射（照射距离,55厘米,剂量率,300c Gy/min,总剂量8.0Gy）,构建受体小鼠造血功能衰竭的骨髓移植模型。随机将雌性受体小鼠分为三组,每组10只。对照组:辐射小鼠后6h内,由尾静脉输入无菌PBS（0.2ml/只）,之后腹腔注射PBS（0.2ml/d）;骨髓移植组（BMT）:辐射受体小鼠后6h内移植雄性供体鼠BMMCs悬液0.2ml/只（含5×10~6个细胞）,同时给予受体小鼠腹腔注射PBS（时间与剂量同对照组）;骨髓移植+当归多糖（ASP）组（TASP）:细胞移植同骨髓移植组,给受体鼠腹腔注入ASP（100mg/kg/d×9d）。BMMCs移植后每天称受体鼠体重,连续9d。移植BMMCs后第9d,处死小鼠取脾脏和骨髓,DNA琼脂糖凝胶电泳检测受体小鼠骨髓细胞与脾集落细胞Y染色体决定基因。2.受体小鼠造血重建功能检测:骨髓移植后第9d,取眼眶血检测血常规,包括WBC、RBC、HGB、PLT各项指标;计数受体鼠每只股骨有核细胞总数;流式细胞术检测受体鼠骨髓细胞的细胞周期。3.受体小鼠造血功能重建机制检测:提取BMMCs,在37℃,含5%CO2的条件下培养BMSCs,观测BMSCs贴壁生长特点;计数成纤维细胞集落（CFU-F）数量;EDU法检测BMSCs增殖能力;ELISA试剂盒测定受体小鼠血清和BMSCs培养的上清液中的相关造血生长因子（HGF）。4.受体小鼠氧化应激相关指标的检测:采用相关试剂盒检测受体小鼠血清中T-AOC和受体小鼠骨髓造血细胞的ROS水平;用q PCR法检测受体小鼠骨髓细胞中抗氧化基因GCLC、GCLM和NQO1的基因表达。实验结果1.对照组小鼠7d内死亡,证明C57BL/6J小鼠的一次性辐射致死剂量为8.0Gy;骨髓移植+ASP组受体小鼠体重恢复明显快于单纯骨髓移植组受体小鼠;在雌性受体小鼠脾集落细胞和骨髓造血细胞能检测到雄性供体鼠Y染色体基因;2.骨髓移植+ASP组受体小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT计数和每只股骨中有核细胞数均显著高于单纯骨髓移植组受体小鼠（P＜0.01,P＜0.05）,且处于G0/G1期的骨髓细胞比率显著降低,S期和G2/M期细胞比率上升（P＜0.05）。3.骨髓移植+ASP组受体小鼠BMSCs无论在贴壁数量、生长能力,还是在形成CFU-F集落数量均明显优于单纯骨髓移植组（P＜0.05）,骨髓移植+ASP组受体鼠血清和骨髓基质细胞培养上清液中粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素3（IL-3）、干细胞因子（SCF）含量显著增高（P＜0.05）。4.骨髓移植+ASP组受体小鼠的T-AOC和抗氧化基因的表达都显著高于单纯骨髓移植组（P＜0.05）,且ROS水平显著降低（P＜0.01）。研究结论1.证明雄性供体小鼠骨髓细胞能成功移植到了雌性受体小鼠体内。2.ASP可以促进移植供体骨髓细胞在受体小鼠体内重建造血。3.ASP促进受体小鼠造血重建的机制可能与改善受体造血微环境和促进造血因子分泌有关。4.ASP可以减轻受体小鼠骨髓造血细胞的氧化应激损伤。