白血病是血液系统的一种恶性肿瘤。近年来随着分子生物学技术的发展,人们对白血病的发病机制已经有了比较深入的了解。染色体异常及其衍生的融合基因在白血病中最常见,其次是基因突变(包括点突变、插入突变、缺失突变等)。近年来,不少融合基因/基因突变又成为重要的靶向治疗的分子标记物,可用于预后判断、治疗方案确立以及微小残留病监控。因此,快速、准确地检测这些标记物在临床上就显得十分重要。本论文以建立白血病的分子诊断为基本出发点,凭借实时PCR技术平台,建立适合临床应用的多重实时PCR检测体系,应用于融合基因和基因突变的筛查或定量,以服务于白血病的诊断、预后和靶向治疗。　　 第一章绪论　　 本章回顾了白血病的早期描述,总结了白血病的分子遗传学基础、MICM分型系统以及各种诊断方法,着重介绍了实时PCR技术的原理和应用,最后提出　　 了本论文的目标、内容及意义。　　 第二章实时PCR用于白血病融合基因的筛查和定量　　 利用实时PCR技术平台,以白血病相关的32种融合基因为对象,建立相应的检测方法。首先通过充分的文献调研确认每种融合基因的各种融合形式,并构建了48个阳性质粒用以验证所有引物和探针的扩增效果。之后针对单个融合基因建立了单重实时PCR体系,进一步发展的多重实时PCR体系只需4个反应就可对32种融合基因约100种融合形式进行筛查。利用144份白血病标本对多重实时PCR体系进行临床验证,共检出73份阳性标本,与单基因实时PCR和测序的结果一致。该体系具有灵敏度高、特异性高、方便快捷、检测全面、价格低廉等诸优点,所采用的引物和探针也可用于后续的微小残留病(MRD)定量,因此具有较大的临床应用价值,可与染色体核型分析互补,用于白血病患者初诊时32种融合基因的筛查以及随访时MRD的监控。　　 第三章急性髓性细胞白血病患者NPM1基因突变的检测　　 以急性髓性细胞白血病(AML)中最常见的NPM1基因突变为研究对象,分别建立了毛细管电泳(CE)、测序、高分辨熔解曲线分析(HRM)和扩增阻碍突变系统引物(ARMS引物)等4种检测方法,相互比较每种方法的检测能力,选出适合临床应用的检测方法。CE法、测序法、HRM法都可以检测所有NPM1突变类型,其中CE法操作繁琐、易污染、价格昂贵、灵敏度为10-20％,测序法有类似的缺点且灵敏度更低(20-30％),HRM法操作方便快捷、价格便宜、灵敏度可达5％。ARMS引物法可以检测95％的NPM1突变,包括A型、B型和D型,灵敏度高达0.01％,可用于MRD定量。综合四种方法各自的特点,考虑到操作难易程度和仪器普及率,结合临床样品检测情况,本研究认为在临床上可以将HRM法和ARMS引物法结合起来用于NPM1突变的筛查,并用ARMS引物法进行后续的MRD定量。　　 第四章 PDGFRB融合基因的克隆、筛查和定量　　 针对一例罕见的儿童慢性嗜酸性粒白血病(CEL)患者进行了一系列的分子诊断。该病人的染色体核型结果为t(1;5)(q21;q33),分子克隆和测序证明CEL细胞带有TPM3-PDGFRB融合基因。该病人采用格列卫进行靶向治疗并迅速达到血液学缓解,同时微小残留病定量结果表明TPM3-PDGFRB的表达也相应降低。最后,我们给出了一个通用的实时PCR定量体系,既可用于初诊时PDGFRB融合基因的筛查,也可用于随访时药物疗效的评价。这些研究结果将有助于儿童CEL患者的确诊、治疗和管理。