miRNA是一类长约22个核苷酸的小分子单链非编码RNA,其在转录后水平对基因表达进行调控,广泛参与机体的各种生理和病理过程。miRNA研究领域迄今为止经历了三次突破:第一个阶段是细胞内miRNA的发现及功能阶段,发现miRNA广泛参与个体发育、组织分化、及癌症的发生发展等过程。第二个阶段是细胞外miRNA的发现及功能阶段,发现血清和血浆中稳定存在miRNA及分泌型miRNA介导细胞间通信的生物学功能。第三个阶段是miRNA在物种间传递的发现及功能阶段,发现并证实了 miRNA可跨物种稳定进行基因调控及遗传信息传递。对应第一个阶段,我们首先研究了细胞内miRNA在癌症发生和发展过程中的功能。目前,细胞内miRNA相关的研究主要聚焦于单个miRNA的功能,对于成簇miRNA的生物学功能尚不清楚。本课题中,我们以miR-23～27～24簇为代表发现其 5 个成员(miR-23a、miR-27a、miR-24、miR-23b、miR-27b)在乳腺癌中均显著上调,且miR-23～27～24簇协同促进乳腺癌细胞迁移并抑制其凋亡;机制研究发现,虽然miR-23～27～24簇的5个成员序列不同,但能够共同靶向HIC1基因的mRNA,而HIC1作为转录抑制因子亦反向作用于miR-23～27～24簇,因此两者的相互调控关系形成一个双负反馈环路;我们通过体内实验和数学模型构建证明了该双负反馈环路可加速乳腺癌的发生发展。我们的研究一方面更加深入的理解成簇miRNA在细胞调控网络中的作用机制,另外也为解析乳腺癌发生发展的分子机制提供新的视角。对应第二个阶段,细胞外miRNA的发现开辟了 miRNA研究领域的新篇章,细胞外miRNA根据其存在形式可分为囊泡依赖性的分泌miRNA(如外泌体包裹的miRNA)和非囊泡依赖性的游离miRNA。囊泡依赖性的分泌miRNA已在国际上引起科学家广泛关注,其在各种生理和病理过程中的功能和作用机制正在被探索和发掘,由分泌miRNA介导的细胞间通讯交流作用也为理解各种生命现象提供了新的角度和方向。然而,依赖于囊泡的分泌miRNA并非是细胞外miRNA的唯一存在形式,研究表明,大量细胞外miRNA实际上是以一种非囊泡依赖性的游离形式存在的,而非囊泡依赖性的游离miRNA的生物学功能和作用机制还远不清楚。肝脏疾病常伴有肺部炎症和损伤,但致病机制尚不明确。我们首先在各种肝脏疾病小鼠模型上证明肝脏损伤的确会导致肺部炎症和损伤;另外,我们发现肝脏疾病发生时,由于肝细胞破裂导致大量的miR-122以非囊泡依赖的形式渗漏到循环系统,并进一步到达肺组织,以配体的形式与TLR7/8受体直接结合从而激活巨噬细胞引起肺部炎症。当我们去除血浆中miR-122后可显著减少肝损伤导致的肺部炎症和损伤,而突变miR-122的结合序列及敲除巨噬细胞的TLR7蛋白后也可阻止肺部炎症和损伤的发生;以上实验证明不依赖微囊泡形式存在的miR-122是导致肝脏疾病相关的肺部炎症的主要致病因子。本研究阐释了非囊泡依赖的游离miRNA的生理病理功能,将完善细胞外miRNA的作用体系,从新角度提出肝脏疾病肺部炎症的发病机理,有望为临床治疗提供新思路。最后,对应于第三个阶段,我们着眼于抑郁症的代际遗传现象,以精子miRNA为主线,系统性研究精子内miRNA介导抑郁症代际遗传的分子机制和作用机理。代际遗传是一种特殊的遗传性状和基因信息的传递方式,外界环境对亲本的刺激是主要诱因。抑郁症作为一种典型的遗传和环境因素共同诱发的精神类疾病,符合代际遗传的基本特征,由于抑郁症的经典遗传学规律长期未能阐释清晰,提示代际遗传可能是适合的新研究切入点。最新的科学发现显示了 miRNA作为代际遗传介质的能力,但其作用机理并不清楚。我们将雄性抑郁小鼠与正常雌性小鼠进行交配,通过行为学、电生理检测和脑区免疫荧光及抑郁症相关基因表达水平检测等都证明了抑郁小鼠产生的子代相较正常小鼠产生的子代具有明显的抑郁易感现象,这说明抑郁症的确存在代际遗传现象。我们进一步对抑郁小鼠的精子RNA进行测序,发现精子内miRNA的数量和表达水平发生了十分显著变化,这提示精子内miRNA可能是参与抑郁症代际遗传过程的主要分子。之后,我们分离纯化了正常小鼠和抑郁症小鼠精子内小片段RNA,利用显微技术注射到正常受精卵并进行胚胎移植,通过行为学、电生理检测和脑区免疫荧光及抑郁症相关基因表达水平检测等都发现注射抑郁症小鼠精子小RNA组所产生的子代小鼠相较注射正常小鼠精子小RNA组所产生的子代小鼠有明显的抑郁易感现象,而在注射的RNA中加入特定miRNA的antisense后可显著回复该现象,这也表明了精子内miRNA的确直接参与了抑郁症代际遗传现象的发生。最后,我们使用单细胞测序技术和生物信息学分析,确定了抑郁症小鼠精子中差异表达的miRNA在早期胚胎中的调控靶点,并在体外和各胚胎发育时期对其调控关系进行验证,同时绘制了精子-胚胎-脑的调控网路图谱,以此解析精子内miRNA介导抑郁症代际遗传的分子机制。通过该研究,一方面将揭示抑郁症的新遗传方式,对全面阐释抑郁症发生的分子机理具有重要意义;另一方面,也丰富了人们对miRNA生物学功能的认识,帮助我们更好地理解miRNA作为介质介导遗传信息传递的规律,并有潜能在未来产生新的药物作用靶点和新的治疗方式。综上所述,本文从细胞内成簇miRNA入手,研究了 miR-23～27～24簇在乳腺癌发展中的作用;同时,我们研究了细胞外不依赖微囊泡形式存在的miR-122介导的肝脏疾病引起的肺部炎症的分子机制;最后,发现了精子内miRNA介导抑郁症代际遗传的分子机制和作用机理。我们通过在不同水平下研究miRNA,将更加深入和系统的理解miRNA的非经典作用模式和机制,发现miRNA的新功能。