目的:　　 细胞色素P4504F2(cytochrome P4504F2，CYP4F2)编码的ω-羟化酶，可将花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)代谢生成二十羟基二十碳四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）。20-HETE一方面通过阻断Ca2+激活的钾通道收缩外周小动脉;另一方面通过抑制肾脏近曲小管和髓袢升支粗段的Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)、Na+/H+交换体(NHE3)、70pS+钾通道(ROMK)和Na+-K+-2Cl-共转运体(NKCC2; SLC12Al)，抑制肾脏水钠重吸收。前期本课题组成功的建立了CYP4F2转基因小鼠，并证明转基因小鼠肾脏CYP4F2蛋白表达增加、20-HETE合成增多、呈高血压表型，推测在正常饮食情况下20-HETE主要表现收缩血管的促高血压作用。为了阐明20-HETE对肾脏水钠代谢的调节作用，我们以CYP4F2转基因小鼠为研究对象进行高盐饲料喂养，并锚定肾脏NKCC2蛋白，深入探讨20-HETE与高盐交互作用对肾脏水钠代谢的具体机制。　　 代谢综合征主要表现为高血压、高血糖、高血脂和肥胖，然而关于代谢综合征患者血压升高的具体机制尚不清楚。许多学者预测肥胖导致近曲小管、髓袢升支粗段和远端小管水钠重吸收增强是引起血压升高的潜在原因。由于20-HETE在近曲小管和髓袢升支粗段发挥抑制肾脏水钠重吸收的利尿钠作用，因此我们推测20-HETE可能参与了代谢综合征患者的血压调节。Dorrance等用高脂饲料喂养SD大鼠10周，发现肾脏CYP4A蛋白表达减少，推测是由于其功能性代谢产物20-HETE合成减少导致机体水钠潴留，引起血压增高;Wang等以Clofibrate（氯贝丁酯）诱导20-HETE合成增加可减轻高脂饮食引起的水钠潴留和血压升高，证实了我们及Dorrance的推测，可见，20-HETE在代谢综合征中发挥着重要的血压调节作用。因此，本研究利用高脂饲料喂养CYP4F2转基因小鼠，借助其高水平的20-HETE背景，围绕肾脏NKCC2蛋白，探讨20-HETE与高脂协同调节NKCC2的具体机制。　　 本研究凭借CYP4F2转基因小鼠模型这一研究平台，分别用高盐、高脂饲料喂养转基因小鼠，旨在深入探讨不同水平20-HETE遗传背景与环境因素（高盐/高脂）相互作用对血压的调节作用及具体机制。　　 材料与方法:　　 一、实验材料:　　 1.FVB/N小鼠　　 2.人HEK-293细胞系　　 3.Real-time PCR相关试剂　　 4.Western blot、免疫组化及免疫共沉淀相关试剂　　 5.基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂　　 6.刺激药物:HET0016、MG132、罗格列酮　　 7.LC/MS相关试剂　　 二、实验方法:　　 1.无创鼠尾血压仪测量小鼠收缩压，生化检测仪检测小鼠24小时尿钠，LC/MS检测小鼠24小时尿20-HETE。　　 2.提取小鼠肾脏总蛋白并定量，Western blot检测高盐饲料喂养及应用HET0016刺激的转基因小鼠肾脏NKCC2蛋白表达。　　 3.4％多聚甲醛固定肾脏组织块，石蜡切片，免疫荧光鉴定NKCC2的表达及定位。　　 4.提取高盐饲料喂养小鼠肾脏总RNA，反转录成cDNA，并通过Real-timePCR检测肾脏NKCC2 mRNA表达。　　 5.免疫沉淀方法比较高盐饲料喂养前后转基因与野生型小鼠肾脏NKCC2蛋白泛素化修饰情况。　　 6.肾脏组织匀浆液与荧光标记的蛋白酶体底物多肽Suc-LLVY-AMC共同孵育，多功能酶标仪检测蛋白酶体活性。　　 7.MG132腹腔注射高盐饲料喂养的小鼠3天，Western blot检测肾脏NKCC2蛋白变化，免疫共沉淀方法检测NKCC2蛋白泛素化水平变化。　　 8.免疫共沉淀方法鉴定NKCC2蛋白与泛素连接酶E3 Nedd4-2蛋白之间的相互作用。　　 9.Real-time PCR检测高脂饲料喂养转基因与野生型小鼠肾脏NKCC2 mRNA表达。　　 10.Western blot检测高脂饲料喂养前后转基因与野生型小鼠肾脏PPAR-γ蛋白表达情况。　　 11.利用生物信息学软件分析小鼠NKCC2基因启动子结构，构建NKCC2基因启动子区系列截短的萤光素酶报告基因重组体，应用双萤光素酶活性检测系统检测启动子活性。　　 12.双萤光素酶活性检测系统检测PPAR-γ对NKCC2基因启动子活性的影响。　　 13.Western blot检测高脂饲料喂养前后转基因与野生型小鼠肾脏NKCC2蛋白表达情况。　　 14.免疫沉淀方法比较高脂饲料喂养前后转基因与野生型小鼠肾脏NKCC2蛋白泛素化修饰情况。　　 结果:　　 一、20-HETE与高盐交互作用经泛素蛋白酶体调节NKCC2表达的机制研究　　 1.高盐饲料喂养后野生型小鼠血压明显升高，而转基因小鼠血压无明显变化。高盐使小鼠尿钠排泄增加，其中转基因小鼠增加程度明显高于野生型小鼠。另外，高盐使小鼠尿20-HETE排泄增加，且转基因小鼠尿20-HETE排泄始终高于野生型小鼠。　　 2.高盐饲料喂养后，转基因小鼠肾脏NKCC2蛋白丰度下降了85％，野生型小鼠下降了24％。高盐饲料喂养的转基因小鼠应用20-HETE合成抑制剂HET0016后肾脏NKCC2蛋白的表达明显回升，说明20-HETE和高盐协同参与NKCC2蛋白的负调控作用。　　 3.Real-time PCR检测小鼠肾脏NKCC2 mRNA表达，发现高盐饲料喂养后小鼠肾脏NKCC2 mRNA与蛋白的变化趋势不一致。　　 4.免疫沉淀结合Western blot结果表明20-HETE与高盐协同作用诱导小鼠肾脏NKCC2蛋白发生泛素化修饰。　　 5.蛋白酶体活性抑制剂MG132恢复了高盐导致的肾脏NKCC2蛋白的减少，并增加了NKCC2的泛素化水平，说明泛素化NKCC2蛋白是经由蛋白酶体途径降解。　　 6.免疫共沉淀检测发现NKCC2蛋白与Nedd4-2蛋白存在相互作用，说明Nedd4-2是诱导NKCC2泛素化的泛素连接酶E3。　　 二、20-HETE与高脂交互作用介导PPAR-γ调节NKCC2转录的机制研究　　 1.高脂使NKCC2 mRNA表达显著增加，其中转基因小鼠增加的程度明显高于同组野生型小鼠，说明20-HETE与高脂协同作用对NKCC2基因存在转录调控作用。　　 2.高脂诱导转基因小鼠肾脏PPAR-γ蛋白表达，推测20-HETE与高脂协同作用通过PPAR-γ调控NKCC2基因表达。　　 3.PPAR-Y激动剂罗格列酮可有效地上调NKCC2基因的转录活性，另外，通过构建系列截短NKCC2启动子萤光素酶报告基因载体，我们将PPAR-γ潜在的反应元件定位于-1462～-1098bp之间。　　 4.高脂喂养后，小鼠肾脏NKCC2蛋白表达减少，并且转基因小鼠显著低于野生型小鼠。　　 5.免疫沉淀和免疫共沉淀结果表明，高脂使肾脏NKCC2蛋白发生泛素化修饰，并且转基因小鼠泛素化程度显著高于野生型小鼠。Nedd4-2是诱导NKCC2泛素化的泛素连接酶E3。　　 结论:　　 1.20-HETE与高盐协同作用，通过泛素连接酶E3 Nedd4-2介导肾脏NKCC2蛋白泛素化修饰，并经蛋白酶体系统降解。　　 2.20-HETE与高脂协同作用，一方面通过PPAR-γ调节NKCC2基因转录活性，另一方面通过泛素化修饰作用降解NKCC2蛋白。