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研究背景和目的目前认为,肿瘤的发生发展是一个多因素参与、多基因改变、多步骤发展的复杂过程。在演化过程中由于瘤细胞遗传不稳定性和宿主环境的选择压力,使细胞不断变异,产生分化及表型的多样性。因此,在同一瘤体内,含有生物学特性和转移行为不完全相同的亚克隆细胞。肿瘤转移的发生是宿主与恶性肿瘤细胞相互作用的结果,是一个高选择性的过程,只有具有转移潜能的细胞亚群才能发生转移,并且转移的肿瘤细胞具有一定的组织倾向性,这是瘤细胞与特定的器官微环境相互作用的结果。因此,分离并鉴定出具有不同转移方向的肿瘤细胞亚克隆,有针对性地比较和分析它们在生物学特性方面的差别,对于探讨肿瘤的转移机制、寻找肿瘤预防和治疗的有效途径有重要的理论和实际意义。肿瘤组织中存在一小部分具有无限增殖能力和肿瘤形成能力的肿瘤细胞,由于其众多特性与干细胞极其相似,人们已认识到肿瘤是一种干细胞疾病。Reya等在2001年提出了肿瘤干细胞理论,此后对肿瘤干细胞的研究逐步深入,从AML（acute myeloid leukemia）到实体瘤的肿瘤干细胞模型的建立和细胞识别分离纯化技术的发展,都对今后肿瘤的有效治疗有重要意义。CD133是一种细胞表面抗原,也被称为prominin-1,含有五个跨膜区域,在细胞外有一个N端结构域,在胞外形成2个大环结构,细胞质内形成2个小环结构,C末端结构域在细胞质内。CD133已经被证实其作为一种干细胞标记物在人类白血病、脑肿瘤、肺癌和前列腺癌及B16黑色素瘤干细胞中的表达,与肿瘤的演进和转移有关。Singh等在包括髓母细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、室管膜细胞瘤及神经节神经胶质瘤在内的一系列脑部肿瘤中分离出CD133+的脑肿瘤干细胞（brain tumorstem cell,BTSC）,Lucia Ricci-Vitianil等和Catherine A.O Brien等在2007年分别用干细胞标记物CD133对结直肠癌进行研究,证明了结直肠癌中CD133+细胞的存在,即在结肠癌中存在具有干细胞特性的细胞亚群。本课题通过有限稀释法对结直肠癌细胞系SW480进行单克隆培养,从而筛选出具有相同遗传背景的单细胞源性子代细胞亚系,利用干细胞标记物CD133进行标记,比较这些CD133+的单细胞源性子代细胞克隆亚系之间的生物学特性,为结直肠癌转移机制的进一步研究建立高转移与低转移潜能的细胞克隆亚系模型。通过对高低转移潜能细胞克隆亚系的进一步研究从干细胞水平阐明结直肠癌转移机制。方法:1.CD133<sub>+单细胞源性SW480细胞克隆亚系的建立利用有限稀释法从母系结肠癌细胞系SW480单克隆培养单细胞源子代细胞亚系。设计CD133特异性引物,提取筛选的各亚系总RNA,利用RT-PCR鉴定各亚系CD133mRNA的表达,免疫细胞化学检测各克隆亚系CD133的表达。建立CD133+的单细胞源性子代细胞克隆亚系。2.BALB/c-nu裸鼠结直肠癌模型筛选不同转移潜能细胞克隆亚系将处于对数生长期的人结直肠癌SW480单细胞源性子代细胞亚系细胞1×106个注射入一只裸小鼠背部皮下,待瘤块直径达8 mm左右时,在无菌的条件下取出瘤块,放入冰的无血清的RPMI-1640培养基（加1%青链霉素双抗）中,用剪刀剪成1 mm3的小块备用。取五只6周龄的BALB/c-nu裸鼠,用1%的戊巴比妥（1ml/kg）将其麻醉后,左下腹切口,用镊子拖出盲肠,刮除少许浆膜组织,用7/0带线缝合针将体积为1 mm3的瘤块荷包式缝合于损伤的浆膜处,将盲肠送回腹腔,缝合腹壁切口。3.高低转移潜能细胞克隆亚系生物学特性分析利用MTT法、平板克隆形成实验、Ki-67标记核抗原检测高低转移细胞克隆亚系体外增殖能力;应用运动小室检测高低转移细胞克隆亚系体外运动能力;应用侵袭小室检测高低转移细胞克隆亚系体外侵袭能力;应用免疫细胞化学检测高低转移细胞克隆亚系抑制肿瘤转移基因nm23及上皮-间质转化标记物CK、Vimentin;应用免疫组织化学检测高低转移细胞克隆亚系所成皮下瘤E-cadherin及EGFR的表达;应用裸鼠皮下成瘤实验检测各克隆亚系成瘤能力及重复裸鼠原位组织块接种实验检测高低转移细胞克隆亚系在体转移能力;应用流式细胞术及Western Blot检测高低转移细胞克隆亚系干细胞标记物CD133、CD44、CXCR4的表达。结果:1.CD133+单细胞源性SW480细胞克隆亚系的建立通过有限稀释法筛选出以结肠癌SW480为母系的单细胞源性子代细胞克隆亚系48个,分别命名为L1-48。共检测细胞克隆亚系33个,其中CD133+细胞克隆亚系30个,CD133-细胞克隆亚系3个。2.BALB/c-nu裸鼠结直肠癌模型筛选高低转移潜能细胞克隆亚系（1）.共进行皮下成瘤实验的细胞克隆亚系33个（30个CD133+亚系和3个CD133-亚系）,其中有31个亚系成瘤,2个亚系未成瘤;CD133+细胞亚系均成瘤,而3个CD133-细胞亚系只有一个有微小瘤形成,2个克隆亚系未见肿瘤形成。（2）.共进行皮下瘤组织块BALB/c-nu裸鼠盲肠原位接种实验的细胞克隆亚系13个,在其中具有较高转移能力（肝转移）的细胞克隆亚系2个L17（5/5）与L26（3/5）;低转移能力（只在接种原位成瘤,未见肝转移）的细胞克隆亚系2个L24（015）与L40（0/5）。3.高低转移潜能细胞克隆亚系生物学特性分析通过MTT法（F=65.484,P＜0.001）、平板克隆形成实验（F=17.937,P=0.001）、Ki-67标记核抗原（F=201.628,P＜0.001）,我们检测了高转移细胞克隆亚系与低转移细胞克隆亚系体外增殖能力,他们之间差别有显著的统计学意义（P＜0.001）。应用运动小室检测结果表明,高转移细胞克隆亚系L17及L26比低转移细胞克隆亚系L24及L40运动能力强,差异具有统计学意义（F=11.380,P＜0.001）:应用侵袭小室检测结果表明,高转移细胞克隆亚系L17及L26比低转移细胞克隆亚系L24及L40侵袭能力强,差异具有统计学意义（F=38.719,P＜0.001）。免疫细胞化学标记转移相关蛋白nm23、EMT（CK、Vimentin）在高转移细胞克隆亚系中抗肿瘤转移蛋白nm23低表达或不表达;在EMT中,两者均高表达CK,高转移细胞亚系可见Vimentin表达,免疫组织化学检测皮下瘤发现高转移亚系E-cadherin低表达,EGFR阳性,而低转移亚系E-cadherin强阳性,EGFR阴性。皮下成瘤实验及裸鼠原位接种实验结果显示,高转移细胞克隆亚系在皮下成瘤及原位接种实验中成瘤及转移能力均强于低转移细胞克隆亚系（P＜0.001）。应用流式细胞术及Western Blot检测高低转移细胞克隆亚系干细胞标记物CD133、CD44、CXCR4的表达结果显示,CD133、CD44、CXCR4在高转移细胞克隆亚系中高表达。结论:1.建立结肠癌SW480单细胞源性子代细胞克隆亚系48个,并获得CD133+细胞克隆亚系30个,CD133-细胞克隆亚系3个;CD133+细胞克隆亚系具有较强的成瘤能力。2.获得高转移（肝转移）细胞克隆亚系2个L17与L26及低转移细胞克隆亚系2个L24与L40。高转移细胞克隆亚系增殖浸润能力强,出现上皮一间质转化。3.具有肿瘤干细胞标记物CD133、CD44、CXCR4表达的结直肠癌SW480克隆亚系浸润与转移特性不同,提示结直肠癌细胞在干细胞阶段出现了生物学行为的异质性,肿瘤转移干细胞的存在可能为结直肠癌转移机制研究提供新的线索。