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目的1.建立大鼠CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的分离和体外扩增方法，并对分离和扩增的CD4+CD25+Treg细胞进行初步鉴定。2.应用永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型，研究体外扩增的CD4+CD25+Treg细胞预防性过继转输对脑梗死大鼠的保护作用。方法1.采用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠脾脏和淋巴结制备组织单细胞悬液，用磁性细胞分选（MACS）方法（也称免疫磁珠法）即阴性选择和阳性选择分离纯化CD4+CD25+Treg细胞，应用抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体、IL-2及雷帕霉素等刺激物与CD4+CD25+Treg细胞共培养进行体外扩增，流式细胞仪分析细胞纯度，台盼蓝染色检测细胞存活率，体外增殖抑制试验（MTT法）检测CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25-T细胞的免疫抑制作用。2.将扩增的CD4+CD25+Treg细胞预防性静脉输注给健康成年雄性SD大鼠，静脉输注移植1天后制作永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。将动物随机分为正常组、MCAO组、HBSS组（MCAO+HBSS输注）、Treg组（MCAO+Tregs输注）。分别于MCAO后3天、1周、2周、3周、4周对各组大鼠进行神经行为学评价，并在MCAO后3天、1周、4周将大鼠处死取脑组织进行TTC染色，计算机图像分析系统测量脑梗死体积并计算出脑梗死体积百分比。各组大鼠于MCAO后3天、1周、4周断头取脑制备脑组织切片，行尼氏染色用显微测量尺测量缺血侧海马CA1区正常锥体细胞数，行TUNEL法用Image-ProPlus图像分析系统检测缺血灶周围细胞凋亡改变。结果1. MACS分选后获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度为88.31%，细胞存活率为96.00%，体外增殖试验表明CD4+CD25+Treg能显著抑制CD4+CD25-T细胞的增殖（P<0.01）。经过3周培养体外扩增的CD4+CD25+Treg细胞纯度为77.20%，活性为96.00%，其抑制功能略强于新鲜分离的CD4+CD25+Treg细胞，其差异具有统计学意义（P<0.01）。2. Treg组Bederson评分显著低于MCAO组和HBSS组（P<0.05）；平衡木实验评分Treg组也显著低于MCAO组和HBSS组（P<0.01）；Morris水迷宫实验Treg组与MCAO组、HBSS组相比大鼠寻找平台潜伏期的时间明显缩短（P<0.01），穿台次数明显增加（P<0.01）；脑梗死体积及脑梗死体积占健侧半球百分比Treg组较MCAO组和HBSS组均显著减小（P<0.01）；缺血侧海马CA1区正常锥体细胞数Treg组较MCAO组和HBSS组显著增多（P<0.01）；缺血灶周围凋亡细胞数Treg组较MCAO组和HBSS组显著减少（P<0.01）。结论1.通过MACS可获得高纯度、高活性的CD4+CD25+Treg细胞，并且具有免疫抑制功能。采用雷帕霉素+抗CD3/CD28单克隆抗体+IL-2在体外成功扩增了高纯度、有活力且不影响其抑制功能的CD4+CD25+Treg细胞。2.扩增的CD4+CD25+Treg细胞预防性静脉输注移植能显著减小大鼠脑梗死体积，降低缺血后神经功能缺损，减轻脑梗死后海马神经细胞损伤，减少缺血灶周围凋亡细胞数量。