蝉花(Isaria cicadae Miquel),也称蝉棒束孢,是寄生在蝉上的一种虫草菌。大量研究证实天然蝉花孢梗束和人工培养的孢梗束及其菌丝体含有多种活性物质,具有显著的生物学活性和药理作用。与天然蝉花及冬虫夏草相比,人工培养的蝉花安全性要比野生产品高,而且从野生资源和环境保护的角度考虑,蝉花的人工培养具有广阔的前景。但是蝉花和其他丝状菌一样,菌株在人工培养基上传代也会出现菌落形态和生长速率的改变等生物学性状的变异,以及产孢梗束能力和目标活性物质产量等生产性状下降的退化现象,从而影响蝉花产品的产量和质量。本研究以蝉花的菌种退化现象为关注点,从蝉花菌种退化过程中的表型、代谢组以及生物活性的变化过程及相互关系,探讨蝉花菌种退化机理和影响。对蝉花在人工培养基上继代培养菌株的生物学特性的研究结果表明,蝉花菌株在人工培养基上继代培养过程中生物学性状表现出阶段性的变异,菌株的产孢量随着传代次数的增加而下降,菌丝生长速度先随传代次数增加而加快,第8代之后生长速度减缓。第8、9代是蝉花菌株继代培养的转折阶段。总地来看,继代培养过程中菌落局变频率没有规律可循,其变异具有菌株的特异性。基于代谢组学的分析结果,蝉花菌株在人工培养基上的继代培养过程可以分为四个阶段：继代培养第1-5代为第1阶段,第7代、第9代分别为第Ⅱ、Ⅲ阶段,第11～15代为第Ⅳ阶段。蝉花各代菌株的代谢物差异与菌株的表型差异在一定程度上形成对应关系,传代第Ⅱ阶段与菌丝生长和产孢力相关的物质如胆碱、甜菜碱、磷脂等物质显著高于第Ⅰ阶段即继代培养前5代,代谢物先于菌株的表型差异表达,具有一定的先兆性。蝉花菌株在人工培养基上的继代培养过程中受到胁迫作用,第9代是一个关键阶段,在此阶段与氧化胁迫反应或菌株抗性相关的氧脂素类物质、甜菜碱类物质、海藻糖、甘露醇、柠檬酸以及丙酮酸等物质均显著高于第1阶段。综合蝉花表型差异研究和代谢组学研究结果可知,蝉花菌株由于在人工培养条件下受到氧化胁迫之类的环境胁迫作用,退化从继代培养的第5代以后开始,第9代为转折点,生产意义上的退化即孢梗束产生能力显著下降即从这个阶段开始。对蝉花的三种不同培养方式产生的培养物,即平板固体发酵和液体摇瓶发酵产生的菌丝以及人工栽培产生的孢梗束,进行基于代谢组学方法的差异代谢物分析,分析结果表明,培养条件对蝉花菌株的代谢影响显著,不同的蝉花活性物质适宜的培养方式不同。液体培养菌丝体中甜菜碱型氨基酸衍生物ulvaline、丙酮酸、N6-(2-羟基)腺苷等物质较少；而甜菜碱、琥珀酸、V-PYRRO/NO、异喹啉碱ampul losine等物质产量较高。固体平板培养菌丝体中香菇菌素、蜜环菌癸素,白僵菌素,海藻糖等物质含量较高。人工栽培的孢梗束中胆碱、环丝氨酸、米曲霉麦角甾醇等物质含量较高,而甘露醇,17-羟基亚油酸,8-羟基亚油酸等物质的含量较低。固体平板培养物和人工栽培的孢梗束中N6-(2-羟乙基)腺苷含量均较高。这说明液体发酵和固体发酵培养方式均适用于产甘露醇的培养,而海藻糖更适宜采用固体发酵培养方式来获得；液体发酵培养不适宜作为生产拮抗抑制剂N6-(2-羟乙基)腺苷的培养方法。用ISSR分子标记技术对蝉花继代培养菌株及角变菌株的遗传多样性进行了分析,结果表明蝉花实验菌株继代培养15代菌株聚类成3组,前5代为一组,7-9代为一组,后5代为一组,这说明随着传代次数的增加,蝉花的基因组DNA也随着继代培养发生变异。变异表现出数量遗传的特性,即随着传代次数的增加而不断积累,到一定代数会表现出质的变化。然而,在逆向的变异过程中,也会出现正向的回复变异。因此,蝉花菌种变异的情况是十分复杂的。该研究结果与代谢组学分析结果形成一定程度的一致性：蝉花的15代菌株基于遗传相似系数也是这样聚为3类,G1、G3、G5代聚为一类,G7、G9聚为一类,G11、G13、G15聚为一类；这与代谢组学研究结果的聚类一致,说明有可能利用简单的ISSR分析来判定复杂的蝉花代谢产物的变化。对蝉花继代培养菌株的清除自由基活性研究结果进一步表明,蝉花供试菌株G1代清除自由基能力比较强；各代菌株清除自由基能力表现出一定的阶段性,G7和G9代是其中的转折阶段。这与表型差异研究、代谢组学分析以及ISSR分析结果基本一致,确证蝉花继代培养7-9代为变异和退化发生的重要转折阶段。三种不同培养方式获得的蝉花培养物在清除自由基活性方面表现出差异性。固体平板培养菌丝体清除DPPH活性较弱,液体培养菌丝体清除·OH自由基活性较弱,而人工栽培获得的孢梗束清除两种自由基的活性均较高。综合以上研究结果,在蝉花的继代培养中,由于人工培养条件与其自然生长条件有很大差别,导致对蝉花产生胁迫作用,这种胁迫影响到相关基因的表达,因而伴随各种形态学和生物学特性的明显变异,蝉花的代谢产物也会发生深刻的变异；简单的ISSR指纹图谱能在一定程度上反映代谢组学的变化；不同的培养方式会产生不同的活性物质；继代培养7～9代为变异和退化发生的重要转折阶段,在蝉花人工培养中需特别注意。在传代初期,其退化是渐变的,人们无法通过常规观察和显微观察发现,但从代谢组或ISSR图谱可以看出变化,因此该方法可提前预知蝉花退化情况。