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β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）是一类能催化(β-半乳糖苷化合物中非还原末端β-D-半乳糖苷键发生断裂的糖苷水解酶。该酶既能催化水解乳糖等β-半乳糖苷化合物以释放半乳糖,也可催化转半乳糖基反应以合成各种半乳糖苷化合物。因此,β-半乳糖苷酶被广泛应用于食品、医药和化学分析等领域。β-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物及动物中,其中微生物由于种类繁多且广泛分布于各种理化环境,能产生性质丰富多样的β-半乳糖苷酶。因此,通过对微生物β-半乳糖苷酶资源进行挖掘是获得具有优良特性酶的一个可行途径。本研究中,作者从耐热枯草芽孢杆菌Bacillus sp.KW1的基因组中鉴定了一个新的GH42家族β-半乳糖苷酶基因ba3238,该基因全长2067 bp,其所编码的蛋白质由688个氨基酸组成。氨基酸序列同源性分析表明,在已进行生化功能鉴定的酶中,Ba3238 与来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的GH42 家族β-半乳糖苷酶Gan42B的序列相似性最高（～57%序列同源性）,表明该酶为一个新酶。克隆ba3238基因并构建获得pET28a-ba3238重组质粒,随后将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中并进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白可获得可溶性表达。作者随后通过His标签纯化树脂进行蛋白质纯化获得重组Ba3238蛋白,对重组酶进行了酶学性质分析。酶学特性分析表明,以乳糖为底物时,Ba3238的最适反应pH为6.5,在新鲜牛乳的pH条件下（pH 6.4-6.8）具有良好酶活力;Ba3238的最适反应温度为45℃,在低温范围内（5-20℃）仍保留有最大酶活性的27-48%,说明该酶具有冷适应特性。在45℃下对Ba3238的pH稳定性进行分析,发现该酶在pH 5.5-11.0的缓冲液中处理24 h后,其活力无明显降低,表明该酶具有良好的pH稳定性。热稳定性研究表明,在40和45℃处理7 h后,该酶的活力依然保持在90%以上,在最适温度范围内有良好的温度稳定性。Ca2+、Mg2+、Co2+等离子对Ba3238的活性有明显的促进作用,而Ag+和Cu2+对其活性有明显的抑制作用。低温水解牛乳实验表明,10℃下2U的Ba3238与1 mL牛奶孵育12 h,牛奶中的乳糖基本水解完全。底物特异性研究表明,Ba3238能够水解乳糖、pNPG、oNPG、pNPA和pNPF,比酶活分别为15.43、158.72、86.99、31.5 和 20.03 U·mg-1,表明该酶对β-D-半乳吡喃糖苷键、α-L-阿拉伯吡喃糖苷键和β-D-岩藻吡喃糖苷键具有活性;将Ba3238分别与多种天然底物半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、中药成分丹皮酚、人参皂苷和岩藻多糖进行共浴后,采用HPAEC-PAD分析水解产物后,发现Ba3238能够水解半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖释放半乳糖;能够水解小麦阿拉伯木聚糖、丹皮酚和人参皂苷释放阿拉伯糖,但是Ba3238无法水解岩藻多糖以释放岩藻糖,因此,Ba3238可被认定为一个新型GH42家族双功能β-半乳糖苷酶/α-阿拉伯吡喃糖苷酶。酶学动力学研究表明,Ba3238在最适反应条件下对乳糖、pNPG、oNPG和pNPA的Km分别为:29.81、2.798、7.858 和 14.21 mM,Vmax 值分别为:22.51、251.69、179.46 和16.62 μmol·min-1·mg-1。同时,我们发现Ba3238和与其同源的木聚糖酶Ba104、同源内切半乳聚糖酶Ba3239具有协同作用:在酶解小麦阿拉伯木聚糖的实验中,由Ba3238和Ba104组成的复合酶所释放的还原糖量比仅使用Ba104单酶的要高出240%;在酶解半乳聚糖的实验中,由Ba3238和Ba3239组成的复合酶所释放的还原糖量比仅使用Ba3239单酶的要高出约75%。β-半乳糖苷酶在乳制品工业中具有广泛的应用,而酶水解乳糖活性的高低是决定酶应用潜能的一个关键指标。在Ba3238的三维结构未知的情况下,为了提高该酶水解乳糖的活性,可通过基于结构模拟的理性设计方法对其进行定向改造。本研究首先以Gan42B三维结构（PDB code:4oif）为模板获得Ba3238的模拟三级结构,在此基础上通过酶-底物分子对接和分子动力学模拟发现,Ba3238与α-乳糖和β-乳糖的结合能（?G）分别为-25.20和-14.71 kcal·mol-1,说明Ba3238对α-乳糖结合的亲和力更高,因此Ba3238与α-乳糖结合的构象更紧凑。通过研究酶与底物结合的构象和结合能分解,本研究鉴定了一组有利于酶-底物结合和催化的关键氨基酸残基,其中对Ba3238与α-乳糖结合贡献较大的残基有ARG119、HIE374、PHE361、GLN362、TRP331、GLU323、GLU371、SER370 和 ASN22,对结合不利的残基有LYS338、LYS372、GLU158、TYR286、PR0326、ASP284、GLY375和ASP20;对Ba3238与β-乳糖结合贡献较大的残基有GLU158、TRP331、ARG119、GLU323和HIE374;对结合不利的残基有 LYS338、TYR286、PR0326、GLU371 和 ASP284。以上关键氨基酸残基的鉴定为进一步通过定点突变改造Ba3238的酶活提供了理论依据。