目的：羟基磷灰石(HA)涂层的Ti种植体是目前种植体表面改性的主要方向,但是随着临床应用的增加,HA涂层在应用上表现出一定的局限性,由于HA在体液中有一定的溶解度,植入一段时间后会出现涂层崩解,导致骨结合失败;脱落的涂层材料颗粒在种植体周围积聚后,激发各种吞噬细胞反应,破骨细胞活跃引起骨吸收,导致种植体松动;涂层脱落使细菌容易侵入,引发种植体周围炎。因此,探求一种理想的加工工艺和方法提高HA涂层与Ti基体结合力,促进种植体早期骨整合,预防种植体周围炎的发生将是我们研究的主要方向。　　 锌作为人体必需的微量元素之一,是很多酶的关键结合因子,在体内参与了300多种酶的代谢,通过调节激素、酶的活性影响骨代谢;Zn2+对细胞的增殖、分化,特别是DNA的合成和有丝分裂有重要的作用,是DNA复制所必须的;能够调节细胞因子的产生,对维持细胞因子的正常结构是必要的,这些细胞因子可诱导骨形成;Zn2+被认为是信号调节分子,参与调节细胞内的信号传导和细胞的生长周期;不仅能够促进成骨细胞的生长而且能够间接抑制破骨细胞骨吸收。同时,Zn2+具有抗菌作用,当到达微生物细胞膜时,牢固吸附并穿透细胞壁进入菌体内,使病原菌的蛋白质变性,破坏细菌细胞合成酶的活性,降低环境的pH值等,使细菌丧失分裂增殖能力而死亡。如果Zn2+能够在种植体周围缓慢释放,不仅能够促进种植体周围骨形成,而且可以预防种植体周围炎的发生。　　 本实验通过微弧氧化(MAO)的方法在Ti表面形成二氧化钛(TiO2)层,多孔的TiO2层可以提高涂层的结合强度和结构的稳定性,通过溶胶凝胶的方法将Zn2+引入到HA涂层中,制备ZnHA/TiO2复合涂层,考察改性材料的表面形貌和化学组成的变化,以及改性材料对成骨细胞的生物学行为和抗菌性能的影响。探索更符合临床需要的种植体材料。　　 方法：　　 一、ZnHA/TiO2复合涂层的制备及性能分析　　 1、Ti表面ZnHA/TiO2复合涂层的制备将直径为10mm的纯Ti棒切割成厚度为1mm的圆片,SiC砂纸打磨。采用BPP-3型MAO电源对样品进行MhO,取一定量P(C2H5O)3、Ca(NO3)2·4H2O、Zn(NO3)2·6H2O,分别得到Ca2+浓度为2mol/L,Zn/Ca摩尔比为0.0025、0.005、0.01三种不同Zn2+浓度的前体溶液,随后用此溶液在样品上分别溶胶凝胶得到实验组样品ZnHA/TiO2-1、ZnHA/TiO2-2、ZnHA/TiO2-3。　　 2、物理形貌和物相分析在JSM-5600LV型扫描电镜上进行HA/TiO2和ZnHA/TiO2涂层后各组Ti片的表面形貌观察。采用XRD-6000型X射线衍射仪对涂层进行物相分析。　　 3、Zn2+释放浓度的测定按照Tris缓冲液与样品表面积为1ml/3cm2的比例,将样品于37℃无菌环境下静置24、48、72、144和288小时,采用电感耦合等离子发射光谱仪(美国Perkin Elmer公司,Optima2000DV)测定各组样品在Tris缓冲液中Zn2+的释放浓度　　 二、ZnHA/TiO2复合涂层的抗菌性能　　 1、牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌实验采用材料表面直接细菌培养法,通过倍比稀释各样本后接种培养,菌落计数观察HA/TiO2和ZnHA/TiOz涂层对P.gingivalis的抑制作用。　　 2、牙龈卟啉单胞菌的扫描电镜观察应用JSM-5600LV型扫描电镜观察Ti片表面牙龈卟啉单胞菌的菌体形态变化。　　 三、ZnHA/TiO2复合涂层的生物相容性　　 1、MTT实验将MG-63制成5×103cells/ml的细胞悬液,接种于3块24孔板中,每板复种3孔,各孔加入500μ l的细胞悬液,分别培养24h、48h、72h,转入新的24孔板,PBS清洗后加入5mg/ml的MTT30μ l,培养4h,吸弃培养液,加入750μ l DMSO,震荡溶解10分钟,将各孔的液体150μ1转入相应酶标板,用酶标仪测定在490nm波长处的吸光度值。　　 2、PI单染法流式细胞仪分析应用PI单染法流式细胞仪分析MG-63在HA/TiO2和ZnHA/TiO2涂层表面培养48h后的细胞周期变化。　　 3、扫描电镜观察通过扫描电镜观察MG-63细胞在HA/TiO2和ZnHA/TiO2涂层表面,分别培养24h、48h后,细胞的形态变化。　　 4、免疫荧光观察FITC结合的鬼笔环肽和PI双染,于激光共聚焦扫描显微镜下观察MG-63细胞在材料表面分别培养24小时、48小时后,细胞骨架的变化。　　 5、Real-time PCR法检测CbfαⅠ、Ostenix、CollagenⅠ、OsteocalcinmRNA的相对表达。　　 MG-63细胞接种到HA/TiO2、ZnHA/TiO2复合涂层Ti片表面,分别培养1天、3天、7天后,收集细胞,提取总RNA,Real-time PCR法检测CbfαⅠ、Osterix、CollagenⅠ、Osteocalcin mRNA的相对表达。　　 结果：　　 一、ZnHA/TiO2复合涂层的性能分析　　 1、表面形貌分析涂层表面上的孔径均匀,直径在1-5μm,涂层表面没有明显的缝隙和裂纹;从截面形貌看,涂层结构致密,厚度均匀,约为10μm,与Ti基体之间没有明显的界面。　　 2、XRD结果分析所有复合涂层中均含有HA相,HA/TiO2组的HA的衍射强度最高,加入Zn2+以后ZnHA/TiO2-1,ZnHA/TiO2-2和ZnHA/TiO2-3组都有HA衍射峰,但是衍射强度比HA/TiO2组明显降低;而加入不同量的Zn2+,HA的衍射强度没有呈现明显的规律性。　　 3、Zn2+释放浓度的测定随着前体溶液中Zn/Ca摩尔比的增加,Zn2+的释放浓度逐渐增加,并且远低于体外的细胞毒性浓度范围。　　 二、ZnHA/TiO2复合涂层的抗菌性能　　 1、菌落计数接种培养在HA/TiO2表面的P.gingivalis样本稀释液的琼脂板上有大量的黑色菌落存在,而接种培养在ZnHA/TiO2表面的P.gingivalis样本稀释液的琼脂板上黑色菌落相对较少,且随着Zn2+浓度增加,其菌落数量逐渐减少。　　 2、菌体形态观察在HA/TiO2涂层表面菌体形态规则,边缘光滑呈球杆状,为P.gingivalis的正常形态。在ZnHA/TiO2涂层表面菌体形态不规则,表现为拉长、弯曲、皱缩,呈长杆状、凹陷状、短杆状和不规则状,菌体大小差别较大。　　 三、ZnHA/TiO2复合涂层的生物相容性　　 1、MTT实验ZnHA/TiO2-1组与对照组HA/TiO2比较24h、48h、72h的OD值差异无统计学意义(p＞0.05),而ZnHA/TiO2-2和ZnHA/TiO2-3组与对照组HA/TiO2比较24h、48h、72h的OD值差异均有统计学意义(p＜0.05),实验组ZnHA/TiO2各组之间均差异无统计学意义(p＞0.05)。　　 2、PI单染法流式细胞仪分析在细胞接种48h后,在ZnHA/TiO2和HA/TiO2之问细胞在S期和G2/M期差异无统计学意义(p＞0.05),但是在ZnHA/TiO2表面的细胞G0/G1期多于HA/TiO2对照组,细胞增殖指数ZnHA/TiO2也比HA/TiO2对照组增多,差异有统计学意义(p＜0.05)。　　 3、扫描电镜观察在ZnHA/TiO2涂层的Ti表面,细胞铺展在多孔的材料表面,向不同的方向伸展,呈多角形;细胞形态饱满,分泌的细胞基质多;可见分裂期细胞,细胞生长活跃;细胞伸出的丝状伪足借助于细胞外基质蛋白黏附于材料表面,沿着材料的小孔周围生长,与材料紧密黏附。而HA/TiO2涂层的Ti片表面,细胞呈圆形或者多角形,细胞伸展不明显。　　 4、免疫荧光观察细胞在材料表面共培养24h后,HA/TiO2涂层的Ti表面成骨细胞呈球形或长梭形,细胞未在材料表面铺展开,而ZnHA/TiO2的表面细胞多数呈多角形,细胞骨架随着Zn2+成分的增加染色逐渐增强,ZnHA/TiO2表面黏附的细胞与对照组比较数量明显增多。48h组细胞已经在ZnHA/TiO2材料表面形成了良好的铺展,细胞骨架中的微丝、微管结构清晰,顺着细胞的伸展方向排列有序,细胞之间形成良好的交通。HA/TiO2材料表面的细胞微丝、微管结构明显减少,细胞形态略显皱缩,在材料表面铺展的面积较小,细胞之间没有形成良好的交通。　　 5、Real-time PCR法检测CbfαⅠ、Osterix、CollagenⅠ、Osteocalcin mRNA的相对表达。　　 MG-63细胞在ZnHA/TiO2表面与HA/TiO2表面生长1,3和7天时实时定量PCR骨相关基因表达的差异。CbfαⅠ mRNA在1天和7天时在ZnHA/TiO2表面比HA/TiO2表面升高,3天的时候降低,差异有统计学意义(p＜0.05)。Osterix mRNA的表达在1天和3天时在ZnHA/TiO2表面比HA/TiO2表面升高,差异有统计学意义(p＜0.05)。ColⅠ mRNA的表达在ZnHA/TiO2表面7天时与HA/TiO2比较升高,差异有统计学意义(p＜0.05)。Osteocalcin mRNA的表达在3天和7天时在ZnHA/TiO2表面比HA/TiO2表面降低,差异有统计学意义(p＜O.05)。　　 结论：　　 1、ZnHA/TiO2复合涂层表面形成均匀、多孔的表面结构。　　 2、Zn2+释放浓度低于毒性浓度范围,并且随着Zn/Ca摩尔比的增加Zn2+释放浓度逐渐增加。　　 3、Ti表面ZnHA/TiO2复合涂层具有抑制P.gingivalis生长的作用。　　 4、Ti表面ZnHA/TiO2复合涂层有促进成骨细胞增殖的性质。　　 5、Ti表面ZnHA/TiO2复合涂层有利于成骨细胞在其表面的黏附及细胞骨架的形成。　　 6、Ti表面ZnHA/TiO2复合涂层促进成骨细胞转录因子CbfαⅠ、Osterix mRNA的相对表达,差异有统计学意义(p＜0.05);促进成骨细胞ColⅠ mRNA的相对表达,降低Osteocalcin mRNA的相对表达,差异有统计学意义(p＜0.05)。