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背景:结肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和致死率逐年上升,正严重的威胁着人类的健康。结肠癌发生发展相关基因的研究有助于发现新的预后预测标志和治疗靶点。近些年许多研究表明,miRNA的改变对于结肠癌的发生、发展及预后发挥着至关重要的作用。因此,miRNA是结肠癌早期诊断和治疗及患者预后预测的潜在标志物,更有可能成为结肠癌分子靶向治疗的潜在靶点。目的:通过临床病例研究探讨miR-544与结肠癌发生发展的关系及其作为分子标志物预测结肠癌患者预后的临床价值。通过细胞学实验证实miR-544在结肠癌中的功能作用,并试阐明miR-544调控结肠癌细胞恶性转化的分子机制。方法:1.采用RT-qPCR方法检测20例配对的结肠癌旁正常组织以及85例结肠癌组织中miR-544表达水平,采用配对t检验比较miR-544在癌组织及正常组织中的表达水平的差异,卡方检验比较结肠癌患者原发组织中miR-544的表达水平与结肠癌患者临床病理因素的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析结肠癌患者组织中miR-544的表达水平与结肠癌患者总生存(overall Survival,OS)的关系,Cox比例风险回归模型评价miR-544作为预后预测分子标志物的临床价值;2.采用RT-q PCR方法检测不同结肠癌细胞系中miR-544的表达水平,分选择出miR-544高表达和低表达的结肠癌细胞系;3.转染miR-544 mimics和miR-544 inhibitor分别使结肠癌细胞过表达miR-544和沉默内源性miR-544表达,通过MTT和克隆形成实验观察miR-544对结肠癌细胞生物学行为的影响,通过Transwell实验观察miR-544对结肠癌细胞生物学行为的影响;4.通过流式细胞术检测miR-544表达对结肠癌细胞细胞周期分布的影响,通过Western blot检测细胞周期相关蛋白pRb和Cyclin D1表达水平;5.通过生物信息学预测miR-544下游调控的靶基因,通过和双荧光酶报告系统结合定点突变技术分析miR-544对下游潜在靶基因FOXO1的调节活性,通过RT-q PCR和Western blot检测miR-544对FOXO1表达水平的影响。结果:1.miR-544在结肠癌组织中的表达高于配对癌旁正常组织(P<0.001);miR-544高表达率在高/中分化的组织学分级较低分化组显著降低(P=0.047),且在淋巴结呈阳性的结肠癌患者组中显著高于淋巴结呈阴性的结肠癌患者组(P=0.005);miR-544高表达的结肠癌患者较低表达患者预后差(P=0.018),但miR-544表达水平不是预测结肠癌患者OS的独立预测因素(P=0.117);2.miR-544在结肠癌细胞HCT116中高表达,在结肠癌细胞HT29中低表达;3.在HT29细胞中过表达miR-544能促进结肠癌细胞的增殖和侵袭能力,在HCT116细胞中沉默miR-544表达能抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭能力;4.在HT29结肠癌细胞中过表达miR-544能促进细胞周期G1至S期转换,伴随pRb和Cyclin D1表达上调,在HCT116结肠癌细胞中降表达miR-544能导致细胞周期G1期阻滞,伴随pRb和Cyclin D1表达下调;5.通过序列比对预测miR-544下游调控的靶基因,结果显示FOXO1 3’-UTR区含有miR-544潜在的结合位点;双荧光报告系统证明miR-544能降低FOXO1 3’-UTR的活性;进一步结合位点突变技术发现,miR-544不能降低miR-544结合位点突变的FOXO1 3’-UTR活性,在HT29结肠癌细胞中过表达miR-544能降低FOXO1 m RNA和蛋白的表达水平,在HCT116结肠癌细胞中降表达miR-544能上调FOXO1 m RNA和蛋白的表达水平。6.在HT29结肠癌细胞中过表达miR-544使mTOR、PI3K和AKT的磷酸化水平提高,而同时外源过表达FOXO1能下调mTOR、PI3K和AKT的磷酸化水。结论:1.miR-544高表达是结肠癌患者早发转移和分化差的分子标志,且可预测结肠癌患者预后;2.miR-544通过抑制FOXO1表达促进结肠癌细胞增殖和侵袭能力;3.miR-544通过调控FOXO1表达促进结肠癌细胞细胞周期进程。4.miR-544通过调控FOXO1表达,影响PI3K/AKT信号通路促进结肠癌进展