肝癌是常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位，死亡率位居第三位，其临床特点是进展快、预后差，5年生存率低于9％。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55％，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。手术切除仍是治疗肝癌最有效的方法，但由于肝癌诸如多灶性、合并肝硬化、早期血管侵犯等，只有不足20％的患者就诊时可以接受手术治疗，其术后极易复发和远处转移，且进展迅速，预后极差。这一现象是最困扰临床医生的治疗难题。因此，如何预防肝癌细胞播散转移是降低肝癌的新发病例数和死亡率的有效方法，而研究肝癌的侵袭和转移及相关机制，对于开发新的、更为有效的肝癌治疗手段，以及降低肝癌患者的死亡率，都具有重要的现实和临床意义。研究证明侵袭能力强的肝癌细胞能分泌基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase) MMP-2和MMP-9，其表达水平与侵袭力呈正相关，其中MMP-2是肿瘤细胞侵袭能力的重要决定因素。　　蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的、多功能的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶，主要存在于细胞质和核质中，是由两个催化亚基（α或α）和两个调节亚基(β)构成的不均一四聚体。蛋白激酶CK2在细胞的存活、生长、增殖及凋亡过程中具有重要作用。近来，大量的研究表明，CK2α在许多人类恶性肿瘤组织中呈现高表达状态，并且与白血病，前列腺癌、胃癌的预后有关。Zou等人的研究表明CK2α在大肠癌组织中表达升高，并且CK2α可以通过调控上皮间质转化相关基因的表达促进大肠癌细胞的侵袭转移。此外，Hubert等人的研究还表明抑制CK2的活性可以降低肝癌细胞中HIF-1的表达。同时，CK2α还可以调控肝癌细胞中的膜蛋白转运。研究表明:蛋白激酶CK2的α或α基因是原癌基因，CK2可能是肿瘤的重要靶分子之一，其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值。有研究证实CK2α在肝癌发生中具有重要且复杂的地位，与肝癌的细胞侵袭转移有一定的关联，然而CK2α在肝癌细胞侵袭，转移中的作用及相关机制仍不十分清楚，是否与上皮间质转化或某些信号通路存在一定关联性还有待进一步研究。但迄今为止国内外有关CK2α基因在肝癌转移中的机制研究尚未见报道，若能明确，则有助于肝癌靶向治疗的研究。　　上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。发生EMT，上皮细胞暂时丧失极性并表现出具有移行能力的间质细胞的现象。当体细胞从上皮样表型向间质表型转换时，其相应的生物学标志会发生改变，如上皮表型标志物E-Cadherin等逐渐丧失，而Vimentin、Slug等间充质表型特征分子表达上调。目前认为肿瘤细胞发生EMT是微环境中作用因子和肿瘤细胞相互作用的结果，这导致细胞通路和基因表达发生改变，最终使肿瘤细胞更富于侵袭性而利于转移。大量的研究表明EMT在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用。其主要表现为细胞黏附分子E-cadherin表达的降低，而细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。E-cadherin是EMT的关键分子，用于维持正常细胞间紧密连接的稳定性，其表达水平与EMT的发生及肿瘤的侵袭能力呈负相关，转录因子如锌指蛋白Snail，SIP-1，Slug，Twist等可下调E-cadherin的表达而促进EMT的发生。Snail、Twist和Slug是EMT的主要调节子，在肝癌组织中，其表达率分别为56.9％、43.1％和51.4％。Snail和Twist是肝细胞癌发生EMT的主要诱导子，对于诱导肿瘤EMT、侵袭和转移具有独立或协同作用。此外，研究显示多种信号通路，如Wnt，TGF-β，Hedgehog等的激活与EMT密切相关。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，且有研究认为EMT是肝癌细胞播散转移的起始步骤。因此，阐明调控恶性肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制，明确其在恶性肿瘤的发生、发展、转移中的病理意义，并探索基于EMT关键分子的诊断方法，以及靶向EMT关键分子的治疗手段是肿瘤转移中EMT机制研究的关键科学问题。　　Hedgehog(Hh)信号通路最初在果蝇中发现，后来证明其在哺乳动物中也广泛存在，参与胚胎的生长发育和器官形成。最初研究认为果蝇和脊椎动物不同物种之间Hh信号通路可能有所差别，但目前研究结果显示果蝇和脊椎动物体内Hh信号通路基本转导过程是一致的。Hedgehog信号通路由配体(Shh、Dhh、Ihh)、两个跨膜蛋白PTCH1和SMO以及下游GLI转录因子(GL11、GLI2、GLI3)等组成。配体Shh与PTCH1跨膜蛋白结合后，可以解除后者对SMO跨膜蛋白的抑制作用，SMO的抑制解除后，可通过GLI转录因子引起众多靶基因的表达，包括PTCH1、GLll、HIP等。其中，PTCH1和GLl1增多还被认为是Hh通路活化的标志。生长停顿特异蛋白1(growth arrestspecificl，GAS1)、人类hedgehog相互作用蛋白(human hedgehog interacting protein，HHIP)和PTCH1是该信号通路中的3个负调控基因。此外，HIP(Hedgehog interactingProtein)可与三种配体结合减弱配体的作用，也被部分研究者用来判断Hh通路的激活状态。近年来越来越多的实验显示，其异常激活能导致多种肿瘤生成，有研究显示Hh信号通路在肝癌中高频率的激活，可能参与肝癌的发生、发展过程，但Hh通路在肝癌细胞中的激活机制以及与肝癌侵袭转移的关系尚不明确。我们预设CK2α与Hh间存在一定调控作用来影响肝癌侵袭转移。　　本研究通过构建CK2α的shRNA干扰质粒，稳定转染体外培养的肝癌细胞，探讨抑制CK2α的表达后对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及相关生物学机制，上皮间质转化，以及Hedgehog信号通路的影响，为深入理解CK2α是否可以作为肝癌靶点及靶向治疗，以及预后因素提供相关资料。　　材料与方法：　　本研究以人肝癌细胞系Hep G2，SK-HEP-1，HuH-7，Li-7为实验材料，应用Western blot检测出CK2α表达水平最高的细胞系，并作为后续实验细胞;设计并合成CK2α基因的干扰片段和无关序列片段，将上述片段分别构建至pGCsi-H1的质粒中，获得pGCsi-H1-CK2α的干扰质粒和pGCsi-H1-control的对照质粒，将质粒转染肝癌细胞，用G418筛选，获得稳定转染pGCsi-H1-CK2α的细胞系和对照细胞系，并应用Real-time PCR，western blot检测稳定转染细胞中CK2α的表达水平进行验证;实验细胞分为非转染组(parental，P)，阴性对照shRNA组(pGCsi-H1-control，PH)，CK2α siRNA转染组（pGCsi-H1-CK2α，PHC）三组;划痕用于检测实验组细胞的迁移能力;Transwell检测细胞的侵袭能力;Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平;Western blot检测细胞间质标志物及转录因子;针对Hh信号通路，应用Real Time-PCR和Western blot检测细胞中CK2α沉默后Gli1，PTCH1和GAS1的表达，免疫荧光检测CK2α沉默后Gli1在细胞中的定位，荧光素酶报告基因检测细胞中转录因子Gli1的转录活性。　　实验结果：　　1.Western blot结果显示，四个肝癌细胞株Hep G2，SK-HEP-1，HuH-7，Li-7均表达CK2α，其中以HepG2中CK2α蛋白的表达水平最高，以HepG2细胞系用作亲代肿瘤细胞(parental cell);　　2.CK2α-RNAi对肝癌细胞中CK2α mRNA表达的影响:CK2α-RNAi转染HepG2细胞第6天时CK2α mRNA表达水平可见到明显变化，CK2α-RNAi组较对照组CK2α mRNA表达水平明显降低;　　3.CK2α-RNAi对肝癌细胞中CK2α蛋白表达的影响:CK2α-RNAi转染HepG2细胞第10天时CK2α蛋白表达水平可见到明显变化，CK2α-RNAi组较对照组CK2α蛋白表达水平明显降低，表明CK2α蛋白表达受到抑制;　　4.划痕实验结果提示CK2α沉默组较对照组细胞迁移率明显下降;　　5.CK2α-RNAi对细胞侵袭力的影响:CK2α-RNAi转染后第10天，Transwell检测发现细胞侵袭力明显降低;　　6.Western blot结果表明，CK2α沉默后细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平明显下降，肝癌细胞侵袭能力下降;　　7.CK2α-RNAi对肝癌细胞中上皮间质转化相关转录因子表达的影响:RNAiCK2α基因后，上皮间质转化相关转录因子除负相关因子E-cadherin表达升高外，其余转录因子如Snail，Vimentin，Slug，Twist表达均显著下降;　　8.CK2α-RNAi对肝癌细胞中Glil mRNA表达的影响:CK2α-RNAi转染Hep G2细胞第6天时Glil mRNA表达水平可见到明显变化，CK2α-RNAi组较对照组GlilmRNA表达水平明显降低;　　9.CK2α-RNAi对肝癌细胞中Glil蛋白表达的影响:CK2α-RNAi转染HepG2细胞第10天时Glil蛋白表达水平可见到明显变化，CK2α-RNAi组较对照组Glil蛋白表达水平明显降低，表明Glil蛋白表达受到抑制;　　10.免疫荧光检测发现Glil蛋白阳性表达主要位于细胞的胞质内，呈红色，RNAi CK2α后，Glil蛋白表达数量下降，呈弱阳性;　　11.荧光素酶结果显示CK2α沉默对Gli1基因活性的起到调控作用，CK2α沉默后GLI1转录活性下降;　　12.CK2α-RNAi对肝癌细胞中Gli1 mRNA表达的影响:CK2α-RNAi转染HepG2细胞第6天时CK2α mRNA表达水平可见到明显变化，CK2α-RNAi组较对照组CK2α mRNA表达水平明显降低;　　13.CK2α-RNAi对肝癌细胞中PTCH1和GAS1 mRNA表达的影响:CK2α-RNAi组较对照组PTCH1和GAS1的mRNA表达水平明显降低;　　14.CK2α-RNAi对肝癌细胞中PTCH1和GAS1蛋白表达的影响:CK2α-RNAi组较对照组PTCH1和GAS1的蛋白表达水平明显降低。　　结论：　　1.CK2α是与肝癌相关的重要癌基因，与肝癌侵袭转移能力呈正相关，可促进肝癌细胞的生长增殖、和增强肝癌细胞的侵袭，使肝癌细胞具有更强的侵袭性。　　2.CK2α表达可抑制上皮标志物表达，促进间质标志物表达，诱导HepG2细胞的EMT进程，进而促进肝癌细胞侵袭转移。　　3.CK2α是Hh信号通路激活的重要因素，CK2α可通过激活肝癌Hedgehog信号通路，进而促进肝癌细胞的发生侵袭转移。　　4.RNAi CK2α后可以体外抑制肝癌细胞上皮间质转化和Hedgehog信号通路，提示CK2α可能通过Hedgehog信号通路抑制上皮间质转化过程。