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背景&目的在发达国家中结肠癌的发病率和死亡率一直高居不下,其所含有的能够体现“干性”特征的癌症干细胞在维持肿瘤的形成、转移及对治疗的抵抗被认为能够解释癌症的异质性和致癌作用,Ascl2在肠道Lgr5+的隐窝干细胞及结肠癌干细胞中发挥着重要作用,其在结肠癌中过表达且能够在肝脏转移中改变干细胞和干细胞的层级从而能够潜在地影响这些肿瘤的临床行为。Ascl2是Wnt信号通路的下游信号,最近有文献报道其可被Hippo信号通路所调控。Hippo信号通路在调控细胞生长速度和器官大小起着决定性的作用,它的核心成分YAP1/TAZ在很多癌症中均激活,其对于癌症的启动、进展或者转移均是至关重要的。这两个信号通路在上皮的发育和稳态中非常重要,而且越来越多的证据证实在上皮组织中Hippo信号通路能够与Wnt信号通路发生crosstalk,因此连接这两个信号通路的分子机制需要进一步的研究。在本实验中我们明确了在结肠癌干细胞内Hippo信号通路调控Ascl2表达的分子机制。黏蛋白Core 3 O-型糖链是被β1,3-N-葡萄糖胺基转移酶-6(β3gnT6,Core 3合酶)所合成,其主要表达在人类的胃、结肠和小肠,而在癌症细胞包括胃癌和结直肠癌中Core3合酶的表达显著降低。Core 3合酶在人类胰腺癌中的异常表达能够通过α2β1整合素的失调从而抑制肿瘤的转移,Core 3合酶在人类结肠癌细胞中的过表达能够抑制癌症细胞的转移能力,但是其机制仍不清楚,在本实验中,我们发现Core 3合酶在结肠癌细胞中的过表达能够诱导MET。方法1.Hippo通路调控Ascl2的机制研究1.1流式分选HT-29和Caco-2得到CD133+CD44+和CD133-CD44-细胞后检测各组增殖、克隆和成球的能力,实时荧光定量PCR及WB检测各组Ascl2、KLF5、Hippo信号通路及“干性”相关基因表达;1.2 si RNA干扰HT-29和Caco-2 CD133+CD44+细胞后WB检测干扰效率,流式细胞仪检测CD133和CD44的比例改变,检测增殖、克隆能力改变,WB检测Ascl2、KLF5、Hippo信号通路及“干性”相关基因表达改变;1.3将含有YAP1过表达的慢病毒转染HT-29和Caco-2细胞后PCR及WB检测过表达效率,流式细胞仪检测CD133和CD44的比例的改变,检测增殖、克隆和成球能力改变,实时荧光定量PCR和WB检测Ascl2、KLF5、Hippo信号通路及“干性”相关基因表达改变;1.4 Co-IP检测HT-29和Caco-2细胞YAP1和KLF5是否结合,Ch IP和双荧光素酶实验阐明YAP1和KLF5是否结合于Ascl2的近端启动子上并激活Ascl2基因的转录;1.5结肠癌组织水平检测Ascl2、KLF5及YAP1的表达水平及相关性分析。2.Core 3 O-型糖链在结直肠癌中诱导MET2.1实时荧光定量PCR检测结直肠癌各细胞系中糖基转移酶的表达情况;2.2将含有Core 3合酶过表达的慢病毒转染HT-29和LS174T结肠癌细胞系,实时荧光定量PCR及WB检测过表达效率;2.3 Core 3合酶过表达后对细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠成瘤细胞等生物学行为的影响;2.4实时荧光定量PCR及WB检测Core 3合酶过表达细胞系及裸鼠瘤内EMT相关指标的改变。结果1.Hippo通路调控Ascl2的机制研究1.1 HT-29和Caco-2分选得到的CD133+CD44+结肠癌细胞的增殖、克隆形成和成球能力更强,Ascl2、KLF5、YAP1和“干性”相关基因表达增高,MST1和p-YAP1表达降低。1.2 CD133+CD44+结肠癌细胞干扰后能够降低增殖和克隆形成能力,CD133+CD44+细胞的比例降低,Ascl2、KLF5、YAP1入核和“干性”相关基因表达减少。1.3 HT-29和Caco-2中YAP1过表达后能够增强其增殖、克隆形成和成球能力增强,CD133+CD44+细胞的比例增高,Ascl2、KLF5、YAP1入核和“干性”相关基因表达减少增加。1.4 YAP1和KLF5在蛋白水平互作并能够结合在Ascl2的启动子上,在YAP1干扰的CD133+CD44+结肠癌细胞中结合减少,在lv-YAP1/HT-29和lv-YAP1/Caco-2结合增加。双荧光素酶和Ch IP实验发现YAP1和KLF5结合在Ascl2近端启动子的前两个位点的GC-box上并诱导Ascl2的转录激活,YAP1干扰后Ascl2的转录减活性降低,过表达YAP1后Ascl2转录活性增高,且GC-box的突变能够导致Ascl2的启动子活性显著降低。1.5 Ascl2,YAP1和KLF5在癌症组织中的mRNA水平相较于正常粘膜显著增高,且Ascl2的mRNA水平与KLF5和YAP1在结肠癌样本中的表达水平显著相关。2.Core 3 O-型糖链在结肠癌诱导MET的实验研究2.1实时荧光定量PCR检测结直肠癌各细胞系中糖基转移酶的表达情况,发现在HT-29和LS174T结肠癌细胞系中Core 3合酶的m RNA水平几乎检测不到;2.2在mRNA水平和蛋白水平检测慢病毒过表达Core 3合酶后表达最有效的克隆,经检测clone 1的Core 3合酶表达最高;2.3在HT-29和LS174T细胞中过表达Core 3合酶能够降低HT-29和LS174T增殖、迁移、侵袭及裸鼠体内成瘤的能力;2.4在β3gnT6/HT-29、β3gnT6/LS174T及其相应的裸鼠肿瘤新生物中m RNA和蛋白水平检测发现E-钙黏素增高而N-钙黏素、snail和slug降低,提示EMT的逆转。结论1.YAP1与KLF5在蛋白水平互作并调控Ascl2的表达从而影响结肠癌干细胞的自更新。2.Core 3 O-型糖链在结肠癌中能诱导MET的发生。