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禽白血病(Avianleukosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)引起的家禽重要肿瘤性疾病之一。病毒感染除了引起鸡群的直接损害外,还造成严重的免疫抑制,生产力下降,混合感染,继发感染等,造成巨大的经济损失,严重危害养禽业的发展。禽白血病病毒编码的p27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。其编码病毒的衣壳蛋白p27蛋白,含量高,占病毒总蛋白成分的30%以上,有许多易于检测的病毒抗原位点,是ALV的群特异性抗原。这些研究结果提示禽白血病病毒的p27基因(ALV-p27)可能在ALV感染宿主细胞致病过程中发挥一定的作用。基于这一设想,本研究建立了ALV-p27基因绝对定量Real time-PCR检测方法,为进一步为研究禽白血病病毒p27基因的生物学功能提供必要的技术方法；同时通过构建ALV-p27真核表达载体,使ALV-p27蛋白在宿主细胞内得以表达,进而研究ALV-p27蛋白对宿主细胞生物学功能的影响；此外初步筛选了与ALV-p27相互作用的宿主细胞蛋白,为进一步研究ALV-p27蛋白与宿主相互作用的分子机制提供线索和理论基础。一、 ALV-p27基因SYBR Green Real time-PCR检测方法的建立及应用设计ALV-p27特异性的荧光定量PCR引物扩增目的基因,将目的基因与pGEM-T载体进行连接,构建p27基因的质粒作为标准品,将鉴定正确的p27基因的质粒进行10倍梯度稀释,用Real-time PCR方法扩增p27基因标准曲线,同时建立检测病毒衣壳蛋白p27基因的绝对荧光定量PCR方法。利用建立的绝对定量PCR方法检测6日龄胚胎感染病毒,一日龄出壳雏鸡不同组织脏器中p27基因的表达情况。建立的检测ALV-p27基因绝对定量PCR的方法为病毒复制提供精准定量检测,为现有病毒p27抗原ELISA检测提供有效的技术补充,同时为进一步研究ALV-p27的生物学功能提供了一种技术手段。二、ALV-p27蛋白抑制细胞因子的表达为研究暂态表达ALV-p27蛋白的DF1细胞在受到LPS和Poly (I:C)刺激时,p27蛋白对细胞免疫反应的影响。本研究将p27基因克隆至pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-p27。将构建好的真核表达载体pcDNA3.1-p27转染至DF1细胞中,加入LPS和Poly (I:C)刺激物,分别在1,6,12,24,48小时收集细胞,利用Real-time PCR检测DF1细胞中炎症因子和抗病毒因子基因表达水平。实验结果显示与空载体转染对照组相比,pcDNA3.1-p27转染DF1细胞组显著抑制IFN-p, IL-6, IL-1β, IL-12等细胞因子的表达。信号通路关键分子检测结果表明,pcDNA3.1-p27的表达显著抑制MYD88,IRF-7的表达。以上实验结果提示,ALV编码的p27蛋白可能通过抑制细胞中炎症因子和抗病毒因子基因的表达,从而导致机体的免疫抑制。其中具体的分子作用机制还需今后进一步深入研究。三、 ALV-p27与宿主细胞相互作用蛋白的初步筛选为了筛选病毒易感细胞中与ALV-p27相互作用的宿主蛋白,本研究利用抗p27蛋白特异性单克隆抗体对暂态表达p27蛋白的DF1细胞和HDl 1细胞进行免疫共沉淀实验,同时利用ALV感染易感细胞后进行免疫共沉淀实验,将3个实验出现的差异蛋白条带进行质谱鉴定。其中三组质谱结果均检测到约71kd和72kd的两个蛋白条带,这两种蛋白分别是葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated Protein, GRP78)和HSPA8。两组质谱结果同时检测到的另外两个相同的蛋白条带约73kd和60kd,分别是HSPA9和ATP5A1蛋白。综合分析所有质谱结果提示GRP78, HSPA8, HSPA9和ATP5A1这4种蛋白可能与ALV-p27在细胞内相互作用,在p27蛋白的生物学功能中发挥一定的作用。这些结果为下一步研究ALV-p27蛋白功能和特性提供了可信的候选蛋白和重要的理论依据。