核因子κB（NF-κB）是细胞核内一种非常重要的转录因子，在许多肿瘤细胞中均存在其异常活化。活化后的NF-κB，不仅可以调节细胞生长和增殖相关基因的表达，更重要的是，它还可上调细胞凋亡抗性分子基因的表达，从而使肿瘤细胞逃避细胞凋亡，成为肿瘤细胞生存的关键因素之一。由于在包括各种类型的急性髓系白血病（AML）原代细胞，白血病干细胞（LSC）以及白血病细胞株如HL-60细胞等在内的多种类型的AML白血病细胞也存在持续活化的NF-κB。因此，NF-κB的异常活化被认为可能参与AML的发生与发展，这也意味着NF-κB很可能是靶向治疗AML的一个潜在性靶分子。NF-κB的活化受到多种因素的调控，其中，IκBα是NF-κB活化调控的一种主要抑制蛋白。通常情况下，IκBα与NF-κB结合而使后者以无活性的形式位于细胞浆中。当细胞受到刺激后，IκBα分子第32位和第36位的丝氨酸被其激酶IKK复合物磷酸化，磷酸化后的IκBα又快速发生泛蛋白化。随后，IκBα被蛋白酶体降解，而NF-κB则与IκBα解离并曝露出其细胞核定位信号，从而进入细胞核，成为活化的NF-κB。很显然，IκBα磷酸化和降解是NF-κB活化调节的关键步骤。因此，抑制IκBα的磷酸化和降解就有可能抑制NF-κB的活化，从而影响其生物学功能。例如，用各种突变型的IκBα（mIκBα）能够抑制多种实体瘤细胞和白血病细胞NF-κB的活化并可引起细胞凋亡；用蛋白酶体抑制剂如MG-132可抑制AML患者LSC内NF-κB的活化并引起细胞凋亡。然而，与其它蛋白酶体抑制剂一样，MG-132也并非为直接作用于NF-κB的特异性抑制物。而且，高浓度或较长时间（24小时以上）的使用MG-132对正常CD34⁺细胞还具有毒性作用。显然，使用蛋白酶体抑制剂来抑制NF-κB的活化并非为最佳的方法。另外，尽管已有通过应用mIκBα来抑制白血病细胞内NF-κB活化的研究报道。但是，在那些为数不多的几个实验中，通常采用的都是以腺病毒（Ad）5为基础构建的Ad载体（AdVec）系统感染而转移第32位和第36位丝氨基酸被非磷酸化丙氨酸替代的mIκBα到靶细胞的方法。然而，有研究发现，除了第32位和第36位丝氨酸外，IκBα分子其它部位氨基酸的磷酸化如第42位酪氨酸磷酸化也与NF-κB的活化有关。更重要的是，通过Ad5为基础的AdVec系统感染转移基因到造血早期细胞如造血干／祖细胞和白血病原始细胞可能比较困难。例如，有研究显示，骨髓细胞以及一些恶性髓系细胞株对Ad5为基础的Ad感染无反应。因此，为克服这些不足之处，非常必要寻找其他的方法。鉴于目前的研究现状，本研究采用一种新型嵌合腺病毒载体系统即Ad5F35 AdVec系统感染的方法将缺失mIκ3αcDNA转移到HL-60细胞以探讨该mIκBα对HL-60细胞凋亡和分化的影响及其作用的可能机制。首先，通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，本研究从高表达IκBαmRNA的鼻咽癌细胞株CNE2细胞内扩增编码缺失了IκBα分子氨基端包括NF-κB活化所需要的磷酸化位点在内的第1～第70个氨基酸序列的mIκBαcDNA即IκBαDN cDNA。然后，经限制性核酸内切酶消化、电泳回收和体外连接并通过中间载体pCR-Script^TM SK（+）将IκBαDN cDNA分别克隆到真核生物表达载体pcDNA3.1（+）、逆转录病毒载体pCLXSN以及腺病毒穿梭载体pDC316内。结果显示，通过RT-PCR技术，从CNE2鼻咽癌细胞成功扩增到IκBαDN cDNA并将其分别重组到pcDNA3.1（+）、pCLXSN和pDC316载体，从而构建到重组pcDNA-IκBαDN、pCLX-IκBαDN和pDC-IκBαDN载体。DNA序列测定结果进一步证实，重组pcDNA-IκBαDN、pCLX-IκBαDN以及pDC-IκBαDN载体携带有未发生任何额外突变的IκBαDN cDNA并且其阅读框架正确。在构建好上述含有IκBαDN cDNA各种重组载体后，本实验进一步制备了携带有IκBαDN cDNA的重组Ad5F35 AdVec系统即Ad5F35-IκBαDN Ad。为有效转移IκBαDN cDNA进入HL-60细胞，首先探讨了重组Ad5F35 AdVec系统感染HL-60细胞的最佳条件。在此基础上，将重组Ad5F35-IκBαDN AdVec系统感染HL-60细胞并通过流式细胞术，NF-κB DNA结合活性实验、Western印迹和实时定量PCR技术分别分析其对HL-60细胞凋亡和分化的影响以及转染后HL-60细胞NF-κB活性，IκBα、细胞凋亡抑制蛋白-2（cIAP-2）和X连锁的凋亡抑制蛋白（x-IAP）mRNA的表达。结果显示，重组Ad5F35-IκBαDN AdVec系统感染HL-60细胞48小时后，Annexin V⁺／PI^-以及Annexin V⁺／PI⁺细胞数为（22.53±2.999）％，而未转染的HL-60细胞其Annexin V⁺／PI^-以及Annexin V⁺／PI⁺细胞数为（4.86±1.366）％，转染重组Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60细胞其Annexin V⁺／PI^-以及Annexin V⁺／PI⁺细胞数平均为（6.08±2.464）％。经统计学学分析，转染重组Ad5F35-IκBαDN AdVec的HL-60细胞与未转染的HL-60细胞以及与转染重组Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60细胞其Annexin V⁺／PI^-和Annexin V⁺／PI⁺细胞数具有显著差异，P值分别是P＜0.001和0.001＜P＜0.002。但是，未转染的HL-60细胞与转染重组Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60细胞其Annexin V⁺／PI^-以及Annexin V⁺／PI⁺细胞数无统计学差异（0.2＜P＜0.5）。然而，Ad5F35-IκBαDN AdVec系统感染HL-60细胞48小时后，表达CD11b和CD14的阳性细胞数极低，与未转染和转染重组Ad5F35-EGFPAdVec的HL-60细胞几乎相同。同时，NF-κB DNA结合活性分析结果显示，感染重组Ad5F35-IκBαDN AdVec系统的HL-60细胞平均NF-κB DNA结合活性为0.14活性单位，而未转染或转染重组Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60细胞平均NF-κB DNA结合活性单位分别为0.43和0.35。Western印迹和实时定量RT-PCR结果显示，感染了重组Ad5F35-IκBαDN AdVec系统的HL-60细胞IκBαDN的表达是增加的，其IκBαmRNA的表达水平分别是未转染和转染重组Ad5F35-EGFPAd HL-60细胞的2.51和3.16倍。与此相反，转染了重组Ad5F35-IκBαDN AdVec的HL-60细胞cIAP-2和xIAP mRNA的表达却是降低的，其表达水平分别是未转染和转染重组Ad5F35-EGFPAdVec HL-60细胞的0.49、0.48和0.42、0.45倍。这些结果表明，嵌合的Ad5F35 AdVec能够有效介导IκBαDN cDNA在HL-60细胞高表达，IκBαDN则可明显抑制HL-60细胞NF-κB DNA结合活性并有效诱导其凋亡，但对HL-60细胞向粒细胞和单核细胞方向分化几乎无影响，IκBαDN对HL-60细胞凋亡的诱导作用可能与其抑制cIAP-2和xIAP mRNA的表达有关。