非食用色素苏丹红I和二苯甲酮酶联免疫检测方法的研究

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苏丹红是一种人工合成的工业染料,二苯甲酮是光引发剂被用于包装材料中,均具有潜在致癌性。本论文旨在建立一种苏丹红Ⅰ、二苯甲酮残留的酶联免疫(ELISA)快速检测方法。   通过重氮化法合成2种苏丹红Ⅰ衍生物,通过LC/MS鉴定后分别与BSA、OVA偶联,得到免疫原和包被原,紫外分光光度法测得偶联率15.6、10.4,用免疫原免疫新西兰大白兔两只,获得多克隆抗体。J检测抗血清得到效价均达到64000,然后选择其中一只兔子的抗血清,初步建立苏丹红Ⅰ的间接竞争ELISA方法。并对包被液,封闭液,样品稀释液,抗体稀释液,一抗反应时间和二抗反应时间等影响苏丹红ⅠELISA反应的因素进行优化,在最优条件下建立了苏丹红Ⅰ的标准曲线,得到线性回归方程为y=-0.3508x+0.6503,R2=0.9989,其中苏丹红Ⅰ的半数抑制量(IC50)为3.0ng/mL,检测限(LOD)为0.1ng/mL,线性范围为0.3~23.4ng/mL,与苏丹红结构类似物对位红交叉率140%、与苏丹红Ⅱ、Ⅲ、G交叉率小于10%,苏丹红Ⅳ交叉率小于1.0%。以辣椒粉为样本,在5ng/g和20ng/g添加水平下得到回收率分别为90.4%和96.0%,变异系数分别为1.8%和4.9%。   以二苯甲酮类似物作为半抗原,采用重氮化法与BSA偶联,合成免疫原,采用戊二醛法与OVA偶联得到包被原,紫外分光光度法测得偶联率分别为17.8和11.5,用免疫原免疫两只新西兰大白兔,获得多克隆抗体。用方阵滴定法得到2只兔子的抗血清效价分别为128000、256000,然后以效价较高的抗血清初步基础建立二苯甲酮的间接竞争ELISA方法。对包被液,封闭液,以及不同pH值、NaCl浓度、甲醇浓度的样品稀释液等影响二苯甲酮ELISA反应的因素进行优化,在最优条件下建立了二苯甲酮的标准曲线,得到线性回归方程为y=-0.3422x+0.9703,R2=0.9976,其中 IC50为23.7ng/mL,LOD为2ng/mL,线性范围为3.2~177.6ng/ml。与其它结构类似物4.4-二N,N-二甲氨基二苯甲酮、2.4-二羟基二苯甲酮的交叉反应都小于1%,抗体具有很好的特异性。以包装纸为样本,在50ng/g和150ng/g添加水平下得到回收率分别为92.8%和94.5%,变异系数分别为2.7%和4.5%。
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